去迷走治療過敏性哮喘有效性的神經(jīng)機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘是全球性的嚴(yán)重健康難題，全世界絕大部分國家的各年齡層的人群均可受到該疾病的不同程度的困擾，而且發(fā)病率逐年增加[1][2]。哮喘的發(fā)病機(jī)制尚不明確。變態(tài)反應(yīng)、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、神經(jīng)等因素及其相互作用與哮喘的發(fā)病關(guān)系密切。臨床上以內(nèi)科保守治療為主的治療手段不能完全控制哮喘的發(fā)作或徹底的治愈。近年來的大量研究證明哮喘發(fā)病與支配氣道的植物神經(jīng)失衡密切相關(guān)，其中迷走神經(jīng)為關(guān)鍵因素之一[3]。刺激迷走神經(jīng)引起支氣管收縮，這在動物實(shí)驗(yàn)

2、中已經(jīng)得到證明，臨床上也觀察到切斷肺門迷走神經(jīng)可使哮喘病人的癥狀得到明顯緩解。但其治療機(jī)制尚未明了，缺乏可靠的理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究。我們在前期研究中成功建立了動物的哮喘模型，并通過手術(shù)實(shí)施雙側(cè)肺門迷走神經(jīng)切斷術(shù)，證實(shí)了該手術(shù)治療方法的可行性及有效性。本實(shí)驗(yàn)通過卵清蛋白(OVA)致敏大鼠，采用霧化吸入的方法成功制作大鼠過敏性哮喘模型，并通過HE染色驗(yàn)證氣道哮喘發(fā)作時炎性加重及迷走切斷后氣道炎性減輕的情況，驗(yàn)證模型制作成功與否以及治療的有效性

3、。由于氣道平滑肌收縮主要由乙酰膽堿、平滑肌、M受體三者所介導(dǎo)，通過Karnovsky—Roots法進(jìn)行膽堿能神經(jīng)染色，了解迷走神經(jīng)切斷后膽堿能神經(jīng)的變化；通過HE染色觀察同一層面平滑肌面積；通過免疫組化方法了解氣道平滑肌M2、M3受體數(shù)量變化，通過觀察膽堿能能神經(jīng)周圍嗜酸性粒細(xì)胞個數(shù)和ICAM-1(膽堿能神經(jīng)與嗜酸性粒細(xì)胞粘附致M2失功能的主要因子)的表達(dá)強(qiáng)度，推斷迷走神經(jīng)切斷后膽堿能神經(jīng)與嗜酸性細(xì)胞粘附能力是否減弱。力求從蛋白水平研究

4、雙側(cè)肺門迷走神經(jīng)切斷術(shù)治療哮喘的有效性的機(jī)制。 目的：1.建立過敏性哮喘和去迷走治療過敏哮喘有效的動物模型。2.從膽堿能神經(jīng)、氣道平滑肌、M受體變化的角度來探討迷走神經(jīng)切斷治療哮喘有效性的機(jī)制。 方法： 1.模型制作及實(shí)驗(yàn)方法。體重300±21g SPF級SD雄性健康大鼠40只，隨機(jī)分成4組：A組(致敏哮喘后切斷迷走神經(jīng)組)，B組(致敏哮喘組)，C組(空白組)，D組(單純切斷迷走神經(jīng)組)，每組10只。A、B組采用

5、OVA腹腔連續(xù)注射3天后，1周后采用OVA霧化吸入，誘發(fā)哮喘發(fā)作，持續(xù)霧化一周后，A組從雙側(cè)頸部切斷迷走神經(jīng)，繼續(xù)霧化一周后處死動物后取病理學(xué)標(biāo)本(從右葉支氣管開口處橫切)；B組行雙側(cè)頸部迷走神經(jīng)假切斷術(shù)，繼續(xù)霧化吸入一周后在同一解剖位置取病理學(xué)標(biāo)本；C組10只，D1-D3生理鹽水腹腔注射，同步霧化吸入生理鹽水，第14天假切斷雙側(cè)頸部迷走神經(jīng)，第21天取材。D組10只，D1-D3生理鹽水腹腔注射，同步霧化吸入生理鹽水，第14天切斷雙側(cè)頸

6、部迷走神經(jīng)，第21天取材。取大鼠右肺中葉，置于4攝氏度生理鹽水漂洗，沖凈血細(xì)胞等，10％甲醛固定后，常規(guī)組織脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片(膽堿能神經(jīng)染色需活組織冰凍切片)，進(jìn)行免疫組化、HE、膽堿能神經(jīng)染色。使用Nikon顯微鏡攝像系統(tǒng)連續(xù)拍照，采用Image—Pro Plus6.0圖象分析軟件對表達(dá)陽性區(qū)域進(jìn)行掃描并測出每張切片8個隨機(jī)視野的IOD值，取其平均值，嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)使用網(wǎng)格法計(jì)數(shù)。 2.檢測指標(biāo)。(1)鏡下對4組肺組

7、織HE切片進(jìn)行“肺組織結(jié)構(gòu)、大支氣管周圍淋巴組織、支氣管收縮程度、支氣管周圍炎癥細(xì)胞、血管周圍炎癥細(xì)胞、肺組織炎性細(xì)胞類型、血管擴(kuò)張、呼吸性細(xì)支氣管內(nèi)粘液”進(jìn)行比較。(2)24組支氣管平均直徑的比較。(3)鏡下平滑肌面積(Area)，膽堿能神經(jīng)、M2、M3受體陽性表達(dá)的IOD(integrated optical density)累積光密度值。(4)膽堿能能神經(jīng)周圍數(shù)量嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量，ICAM-1(膽堿能神經(jīng)與嗜酸性粒細(xì)胞粘附主要因子

8、)的IOD(integrated optical density)累積光密度值。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究采用的評價指標(biāo)為連續(xù)型變量，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上采用四組隨機(jī)對照的方法，數(shù)據(jù)以統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0處理。四組之間各評價指標(biāo)都進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布和方差齊者使用多組均數(shù)間方差分析，方差不齊者或不符合正態(tài)分布使用多組基于秩次的非參數(shù)檢驗(yàn)。凡涉及均數(shù)結(jié)果以X±S形式給出，當(dāng)P<0.05時認(rèn)為差異具有顯著性。

9、對于需要進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)，對符合正態(tài)分布的使用pearson相關(guān)，對不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用spearman相關(guān)進(jìn)行分析，當(dāng)P<0.05時認(rèn)為具有相關(guān)性(r<0.3不顯著相關(guān)0.8>r>0.5輕微相關(guān)r>0.8顯著相關(guān)r為相關(guān)系數(shù))。 結(jié)果：1.鏡下各組病理學(xué)差異見表(1)；A、B、C、D組直徑分別為：444.1±37.4、293.1±30.9、447.7±45.7、452.5±44.0。B組與A、C、D組直徑差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義(P<0.05)，A、C、D三組差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.各組氣道同一視野下平滑肌面積，A、B、C、D四組面積(Area)值分別為0.53±0.04；0.54±0.03；0.50±0.09；0.52±0.08。四組平滑肌面積值(Area)總體均數(shù)差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3.各組膽堿能神經(jīng)染色的IOD(integrated optical density)累積光密度值差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，

11、A、B、C、D各組膽堿能神經(jīng)表達(dá)分別為2.44±0.16、5.16±0.44、1.24±0.61、2.57±0.30(單位為百萬象素)，各組IOD值差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4.各組M2受體免疫組化陽性顆粒IOD值。A、B、C、D四組IOD值分別為3.81±0.25；3.29±0.65；1.92±0.24；1.25±0.93(單位為百萬象素)，各組IOD值差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5.A、B、C、D四組M3表達(dá)的

12、IOD值秩次分別為28.10，19.70，16.80，17.40，但總體比較各組IOD值差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。6.A、B、C、D四組膽堿能神經(jīng)周圍平均嗜酸性粒細(xì)胞個數(shù)分別為3.8±1.9；10.8±2.3；3.2±2.0；3.1±1.5。其中B組(哮喘組)明顯高于其他組P<0.05，其余三組差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。7.A、B、C、D四組ICAM-1的IOD值分別為5.29±0.88；5.98±0.60；4.

13、01±0.57；3.43±0.61。四組陽性表達(dá)IOD值總體均數(shù)差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。8.膽堿能神經(jīng)表達(dá)與氣管直徑有負(fù)相關(guān)性：P=0.00 r=—0.66；與M2、M3無相關(guān)性(P>0.05)．9.膽堿神經(jīng)和EOS、膽堿神經(jīng)和ICAM-1、EOS和ICAM-1有正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.619、0.635、0.627。 結(jié)論： 1.成功建立過敏性哮喘和去迷走治療過敏性哮喘有效的大鼠模型。 2.迷