黃芩苷對(duì)動(dòng)物過(guò)敏性哮喘的治療作用及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:本課題研究黃芩苷對(duì)于豚鼠以及哮喘模型小鼠的治療作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　 方法:
　　 1、黃芩苷對(duì)豚鼠離體氣管的影響作用。
　　 取離體豚鼠氣管，將豚鼠氣管剪成寬約3mm，長(zhǎng)約20mm的螺旋氣管條，懸掛于盛有20mlK-H營(yíng)養(yǎng)液的恒溫(37℃±0.5)的麥?zhǔn)皆〔壑?，上端接肌肉張力換能器，傳入RM6240B/C生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集處理系統(tǒng)，觀測(cè)不同濃度的黃芩苷溶液對(duì)乙酰膽堿(Ach)或組胺(

2、His)誘發(fā)的豚鼠氣管平滑肌收縮的影響。
　　 2、黃芩苷對(duì)豚鼠引喘潛伏期的影響作用。
　　 30只健康豚鼠，雌性，體重200±20g，隨機(jī)分為5組，于4L密閉玻璃鐘罩內(nèi)用乙酰膽堿及組胺混合溶液引喘，分別給予黃芩苷和陽(yáng)性對(duì)照藥?kù)F化吸入后，觀察豚鼠狀態(tài)，記錄豚鼠引喘潛伏期。
　　 3、小鼠哮喘模型實(shí)驗(yàn)。
　　 3.1、小鼠哮喘模型的制備。
　　 48只SPF級(jí)健康BALB/c小鼠，隨機(jī)分為6組，分別

3、為正常組，模型組，陽(yáng)性藥組，黃芩苷低中高劑量給藥組。采用卵蛋白(OVA)致敏，激發(fā)，制作小鼠支氣管哮喘模型，觀察記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模前后精神狀態(tài)，生理指征。第0、7天卵蛋白(OVA)致敏液腹腔注射致敏，從第14天起開(kāi)始霧化吸入2％卵蛋白溶液激發(fā)，連續(xù)6天，每天一次，每次30分鐘;給藥組激發(fā)前1小時(shí)霧化吸入給予黃芩苷低、中、高劑量中性溶液，空白對(duì)照組致敏液，激發(fā)液，治療藥液均用0.9％生理鹽水替代，第21天取材。
　　 3.2、檢測(cè)模

4、型小鼠免疫器官臟器系數(shù)。
　　 迅速摘取實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈笃⑴K以及胸腺，記錄哮喘小鼠模型試驗(yàn)中各組小鼠脾臟及胸腺臟器系數(shù)。
　　 3.3、HE染色法觀察各組小鼠肺臟組織的形態(tài)變化。
　　 迅速摘取實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈笞髠?cè)肺臟，置于中性4％甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，觀察各組哮喘模型小鼠肺臟組織的形態(tài)學(xué)變化。
　　 3.4、ELISA(酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn))法檢測(cè)各組小鼠血清中IL-4，IFN-γ的含量。<

5、br>　　 取各組哮喘模型小鼠血，靜置1小時(shí)后離心取上層血清，ELISA試劑盒檢測(cè)各組哮喘模型小鼠血清中IL-4，IFN-γ的含量。
　　 3.5、應(yīng)用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)檢測(cè)各組小鼠IL-4，IFN-γ的mRNA的表達(dá)水平。
　　 取實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈笥覀?cè)肺臟，提取各組模型小鼠肺臟組織總RNA，應(yīng)用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)檢測(cè)各組哮喘模型小鼠肺臟組織中IL-4，IFN-γ的mRNA的表達(dá)

6、水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、黃芩苷對(duì)豚鼠引喘潛伏期的作用。
　　 豚鼠引喘潛伏期實(shí)驗(yàn)中，黃芩苷能夠延長(zhǎng)組胺和乙酰膽堿混合噴霧所引起的豚鼠引喘潛伏期，中劑量及高劑量(15mg/ml、50mg/ml)與對(duì)照組具有顯著差異(P＜0.05)，說(shuō)明黃芩苷能對(duì)組胺和乙酰膽堿混合噴霧所引起的豚鼠藥物性哮喘具有保護(hù)作用，能夠改善乙酰膽堿和組胺引起的支氣管痙攣。
　　 2、黃芩苷對(duì)離體豚鼠氣管的舒張作用。
　　

7、 黃芩苷對(duì)乙酰膽堿和組胺誘導(dǎo)的氣管平滑肌收縮具有明顯的拮抗作用。對(duì)于乙酰膽堿誘導(dǎo)的豚鼠支氣管平滑肌收縮，加入黃芩苷0.046、0.092、0.184mmol/L孵育30分鐘之后，可使乙酰膽堿累積濃度量效曲線右移，對(duì)豚鼠氣管平滑肌的最大張力無(wú)影響，顯示出黃芩苷對(duì)于乙酰膽堿具有比較顯著的非競(jìng)爭(zhēng)拮抗作用，提示黃芩苷非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗氣管平滑肌M受體從而達(dá)到抑制乙酰膽堿引起氣管平滑肌收縮的目的。對(duì)于組胺誘導(dǎo)的豚鼠支氣管平滑肌收縮，加入黃芩苷0.046

8、、0.092、0.184mmol/L孵育30分鐘之后，可使組胺累積濃度量效曲線右移，對(duì)豚鼠氣管平滑肌的最大張力無(wú)影響，提示黃芩苷能夠非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗氣管平滑肌H受體從而達(dá)到抑制氣管平滑肌收縮的目的，顯示出黃芩苷對(duì)于組胺拮抗作用略低于對(duì)乙酰膽堿拮抗作用。
　　 3、黃芩苷對(duì)于哮喘小鼠免疫器官的作用。
　　 黃芩苷能夠降低胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)，中、高劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明黃芩苷能夠逆轉(zhuǎn)模型引起的免

9、疫應(yīng)答過(guò)程，同時(shí)改善炎癥對(duì)于小鼠機(jī)體的影響。
　　 4、黃芩苷對(duì)于小鼠支氣管哮喘的治療作用。
　　 各組哮喘模型小鼠肺臟組織HE染色結(jié)果顯示，BABL/c小鼠哮喘模型對(duì)照組和正常小鼠相比，主要表現(xiàn)為支氣管周圍炎癥以及血管周圍炎癥。炎癥細(xì)胞的類型主要為單核巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，并可見(jiàn)少數(shù)淋巴細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞。此外伴有間質(zhì)性肺炎病變。給予哮喘模型小鼠黃芩苷低、中、高中性溶液霧化吸入治療之后，能夠減輕支氣管哮喘的

10、癥狀以及肺臟間質(zhì)炎癥的病變程度，其中低劑量組效果略差，中、高劑量組效果較好。
　　 5、黃芩苷對(duì)于哮喘小鼠血清中IL-4以及IFN-γ的影響。
　　 黃芩苷對(duì)小鼠血清中IL-4的影響:結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比較，哮喘模型組、黃芩苷低劑量治療組和布地奈德陽(yáng)性對(duì)照組血清中IL-4含量均明顯升高(P＜0.01）。
　　 與哮喘模型組相比:中、高劑量黃芩苷治療組以及陽(yáng)性藥布地奈德治療組血清中IL-4有明顯降低(P＜0.

11、01）。
　　 黃芩苷對(duì)小鼠血清中IFN-γ的影響:結(jié)果表明，于正常對(duì)照組相比較，哮喘模型組、黃芩苷低劑量治療組和布地奈德治療組血清中IFN-γ含量均明顯降低（P＜0.01）。
　　 與哮喘模型組相比:中高劑量黃芩苷治療組以及陽(yáng)性藥布地奈德治療組血清中IFN-γ有明顯升高(P＜0.01）。
　　 6、黃芩苷對(duì)哮喘小鼠肺臟組織中IL-4以及IFN-γmRNA表達(dá)量的影響。
　　 黃芩苷對(duì)哮喘小鼠肺臟組織中I

12、L-4mRNA表達(dá)的影響:RT-PCR結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比較，哮喘模型組、黃芩苷低劑量治療組和布地奈德治療組肺臟組織中IL-4mRNA表達(dá)量均明顯升高，(P＜0.01）。說(shuō)明模型建立成功。與哮喘模型組相比:中、高劑量黃芩苷治療組以及布地奈德陽(yáng)性對(duì)照組肺臟組織中IL-4mRNA表達(dá)有明顯降低。(P＜0.01)。說(shuō)明黃芩苷能夠降低哮喘小鼠肺臟組織中IL-4的含量。
　　 黃芩苷對(duì)于哮喘小鼠肺臟組織中IFN-γmRNA的影響:R

13、T-PCR結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比較，哮喘模型組、黃芩苷低劑量治療組和布地奈德治療組肺臟組織中IFN-γmRN表達(dá)量均明顯降低，(P＜0.01）。說(shuō)明模型建立成功成功。與哮喘模型組相比:中高劑量黃芩苷治療組以及陽(yáng)性藥布地奈德治療組哮喘小鼠肺臟組織中IFN-γmRNA表達(dá)有明顯升高。(P＜0.01)。說(shuō)明黃芩苷能夠提高哮喘模型肺臟組織中IFN-γ的表達(dá)。
　　 RT-PCR結(jié)果中IL-4與IFN-γmRNA的表達(dá)與血清中檢測(cè)到的

14、IL-4和IFN-γ含量的偏移趨勢(shì)相一致，均顯示出黃芩苷降低哮喘模型小鼠肺臟組織中IL-4的表達(dá)，提高IFN-γ的表達(dá)，說(shuō)明黃芩苷能夠逆轉(zhuǎn)哮喘過(guò)程中發(fā)生的Th1/Th2失衡狀態(tài)，從而在一定程度上達(dá)到緩解哮喘癥狀的作用。
　　 結(jié)論:黃芩苷能夠?qū)﹄嗍笾夤芷交‘a(chǎn)生舒張作用，能夠擴(kuò)張支氣管平滑肌，拮抗乙酰膽堿和組胺引起的支氣管痙攣收縮，緩解哮喘癥狀。對(duì)哮喘模型中發(fā)生的脾臟、胸腺等免疫器官發(fā)生的免疫應(yīng)答有一定的逆轉(zhuǎn)作用。黃芩苷能夠逆