Treg細(xì)胞在小鼠過(guò)敏性哮喘中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：過(guò)敏性支氣管哮喘是一種以T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞和一系列細(xì)胞因子參與的,以氣道慢性炎癥為特征的疾病,目前我國(guó)哮喘患病率約為1％,兒童可高達(dá)3%,且呈上升趨勢(shì),該病的確切發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。大量的研究表明,過(guò)敏性哮喘患者體內(nèi)存在Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞的比例失衡,即過(guò)敏性哮喘是Th2細(xì)胞過(guò)度分化導(dǎo)致的過(guò)敏性疾病,然而,也有研究發(fā)現(xiàn),與Th1細(xì)胞相關(guān)的炎癥反應(yīng)并不能減弱支氣管哮喘的發(fā)病,傳統(tǒng)的Th1/Th2比例

2、失衡理論并不能完全解釋過(guò)敏性支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)是機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)呼吸道炎癥過(guò)程的細(xì)胞,并可能在過(guò)敏性哮喘的發(fā)病和發(fā)展機(jī)制中起到關(guān)鍵性的作用;Treg細(xì)胞在體內(nèi)的重要作用是免疫無(wú)能性和免疫抑制性,它可以調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)非病原體抗原如過(guò)敏原的耐受性,并參與調(diào)節(jié)抗原引起的免疫炎癥反應(yīng);Treg細(xì)胞可能與過(guò)敏性哮喘的發(fā)生與進(jìn)展都有密切的關(guān)系,有研

3、究發(fā)現(xiàn),在過(guò)敏性哮喘患者的外周血中,Treg細(xì)胞的數(shù)量及功能均有不同程度的降低,但Treg細(xì)胞作用的具體機(jī)制目前還不完全清楚;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)和白細(xì)胞介素-35(IL-35)是由CD4+CD25+Treg細(xì)胞分泌的,具有抑制免疫應(yīng)答作用的細(xì)胞因子,它們可能是Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用的重要介質(zhì)。
　　 方法：⑴將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,模型組小鼠復(fù)制哮喘模型。⑵觀察兩組小鼠被

4、OVA或生理鹽水激發(fā)時(shí)的表現(xiàn),取肺組織做病理HE染色,用全身體積描計(jì)儀(WBP)檢測(cè)小鼠氣道反應(yīng)性,并檢測(cè)支氣管肺泡灌沈液沉淀中嗜酸性粒細(xì)胞百分比,用上述檢測(cè)結(jié)果來(lái)判定模型復(fù)制是否成功,模型復(fù)制成功后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。⑶對(duì)照組和模型組小鼠行支氣管肺泡灌洗,灌洗液離心后用ELISA方法檢測(cè)上清中OVA特異的IgE、IL-4、IL-10、IL-35和TGF-β1等細(xì)胞因子的水平。⑷分離小鼠血液和脾臟中單個(gè)核細(xì)胞層,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD2

5、5highTreg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比,并應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中OVA特異的IgE、IL-4、IL-10、IL-35和TGF-β1等細(xì)胞因子的水平。⑸提取兩組小鼠肺組織的RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用SYBR Green I熒光定量PCR的方法檢測(cè)每個(gè)標(biāo)本中EBI3、P35、IL-10和Foxp3基因的相對(duì)表達(dá)水平。⑹應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析;采用GraphPad Prism5進(jìn)行各種統(tǒng)計(jì)圖的制作;SY

6、BR Green I熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法分析基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　 結(jié)果：①成功復(fù)制了小鼠過(guò)敏性哮喘模型。②與對(duì)照組相比,哮喘模型組小鼠支氣管肺泡灌洗液沉淀中嗜酸性粒細(xì)胞百分比顯著增加(P＜0.05);支氣管肺泡灌洗液和血清中OVA特異的IgE和IL-4水平明顯提高(P＜0.05),IL-10、IL-35和TGF-β1水平顯著降低(P＜0.05)。③與對(duì)照組相比,哮喘模型組小鼠血液和脾臟中CD4+CD2

7、5highTreg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比顯著下降(P＜0.05)。④與對(duì)照組相比,哮喘模型組小鼠肺組織中EB13和P35 mRNA的相對(duì)表達(dá)量有所下降但不明顯,而IL-10和Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯下降。
　　 結(jié)論：本次試驗(yàn)的研究結(jié)果提示:Treg細(xì)胞可能和過(guò)敏性哮喘有密切的關(guān)系,Treg細(xì)胞數(shù)量的減少或其分泌的抑制性細(xì)胞因子水平的降低可能在過(guò)敏性哮喘的發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵性的作用,Treg細(xì)胞可能是治療過(guò)敏性