第一部分-誘導(dǎo)供體特異性耐受的人鼠嵌合HLA-A2二聚體的構(gòu)建及表達(dá);第二部分-體外研究IL-21和雷帕霉素單用或聯(lián)用對(duì)抗原特異性T細(xì)胞表型的影響.pdf

1、器官移植給各種組織和器官終末期患者帶來了希望,然而,移植排斥反應(yīng)依然是目前所面臨的一項(xiàng)艱巨挑戰(zhàn),誘導(dǎo)移植耐受是目前亟待解決的問題?，F(xiàn)有的免疫抑制劑在維持免疫耐受的同時(shí),使病人容易受到感染和罹患惡性腫瘤以及藥物相關(guān)毒性副作用等缺點(diǎn).研究顯示,MHC-IgG二聚體在體外可以誘導(dǎo)供者特異性的同種T細(xì)胞耐受。因此,我們嘗試去回答二聚體是否可以抑制排斥反應(yīng)。為此,我們構(gòu)建、克隆和表達(dá)了HLA-A2-IgG2bFc二聚體。利用重疊PCR將兩個(gè)不同基

2、因片段連接,插入pcDNA3.1,形成pcDNA3.1HLA-A2β2α1α2murineα3克隆質(zhì)粒。IgG2bFc片段通過酶切、連接形成表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1HLA-A2β2α1α2murineα3IgG2bFc轉(zhuǎn)染入J558L細(xì)胞。G418抗性篩選單克隆,然后,通過ELISA證實(shí)轉(zhuǎn)染是否成功。通過單向MLC的方法檢測(cè)表達(dá)的可溶性二聚體是否能抗抑制排斥反應(yīng)的能力。我們利用攜帶有HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠作為供體,攜帶有HLA-A24轉(zhuǎn)基

3、因鼠作為受體,MLC結(jié)果表明CD4+T的增殖顯著被二聚體抑制。這和我們預(yù)期的結(jié)果相悖,我們認(rèn)為二聚體可能對(duì)CD8+T細(xì)胞增殖有影響,但是沒有檢測(cè)到其增殖。后續(xù)研究還將繼續(xù),旨在回答上述問題。
　　腫瘤特異性T細(xì)胞在宿主中植入和長期存在是其過繼治療取得效果的先決條件。這就需要過繼大量的可長期存在的腫瘤特異性T細(xì)胞消除腫瘤細(xì)胞。因此,如果我們要對(duì)抗癌癥,那么就需要開發(fā)有效的方法來制備長期存在的腫瘤特異性記憶T細(xì)胞。本研究中,我們通過單

4、用或聯(lián)用Il-21和雷帕霉素,評(píng)估其在抑制激活細(xì)胞向效應(yīng)細(xì)胞分化的同時(shí)保持和擴(kuò)增有干細(xì)胞特性的中樞記憶性T細(xì)胞(Tscm)亞群的能力。通過這種方法,Tscm將不斷產(chǎn)生腫瘤抗原特異性T細(xì)胞來消除腫瘤組織。已有的研究表明Il-21和雷帕霉素具有抑制T細(xì)胞分化的能力,所以在實(shí)驗(yàn)中被用作激活劑或抑制劑。并且,雖然還存在其他的抑制T細(xì)胞分化的試劑,但是我們可以通過Il-21和雷帕霉素更容易取得理想的實(shí)驗(yàn)效果。除此之外,目前為止還沒有研究證實(shí)單獨(dú)或

5、同時(shí)用兩者可能的效果。首先我們分離健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞,然后與加載了AFP肽的T2細(xì)胞在24孔板中共培養(yǎng),產(chǎn)生T2/AFP特異性T細(xì)胞,并以單獨(dú)或聯(lián)用的方式加入Il-21和雷帕霉素。處理后1周、2周、3周、4周和6周分別收集細(xì)胞,用特異性表面標(biāo)志CD3,CD8,CD44,andCD62L流式細(xì)胞儀檢測(cè)。6周后通過分析發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用雷帕霉素可以顯著抑制Tscm的分化。然而,研究表明聯(lián)合應(yīng)用Il-21和雷帕霉素時(shí),在第二周Tscm出現(xiàn)最