電針改善阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能并減輕β樣淀粉酶沉積和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的研究.pdf

1、【背景】：阿爾茨海默病是一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為癡呆、記憶缺失、性格改變及語言障礙。其不僅起病隱匿、病情遷延漸進(jìn)、癡呆癥狀嚴(yán)重干擾病人日常生活，發(fā)病率也呈現(xiàn)年輕化、加重的趨勢(shì)。美國(guó)在2000年的阿爾茨海默病發(fā)病例數(shù)約為450萬例，而中國(guó)最新的調(diào)查發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患病率在60歲以上人群中為2.21％，65歲以上為3.00％，70歲以上高達(dá)4.69％。面對(duì)如此嚴(yán)重的病情和龐大的患病人群，阿爾茨海默病的治療卻仍

2、處于藥物局限、療效欠佳的階段。因此尋求一種能夠有效、安全治療阿爾茨海默病的藥物和方法迫在眉睫。
　　祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)電針（Electroacupuncture，EA）刺激相應(yīng)穴位能夠?qū)Χ喾N中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用并能進(jìn)一步改善疾病所致神經(jīng)行為學(xué)缺損。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究已經(jīng)證實(shí)電針刺激“百會(huì)穴”可誘導(dǎo)中風(fēng)后腦的快速相和延遲相的缺血耐受，顯著降低腦梗死容積并對(duì)中風(fēng)后學(xué)習(xí)認(rèn)知功能損傷具有明顯的改善作用。電針在高持續(xù)性正加速度

3、所致中樞神經(jīng)損傷中也具有顯著改善神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)的作用。此外，國(guó)內(nèi)外大量的研究證實(shí)電針刺激可促進(jìn)損傷部位腦組織神經(jīng)發(fā)生數(shù)量的增加，這可能與電針的腦保護(hù)作用密切相關(guān)。但電針刺激對(duì)同為神經(jīng)病變的阿爾茨海默病是否也具有改善行為學(xué)表現(xiàn)和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的作用目前并不十分明確。
　　目前得到國(guó)內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)公認(rèn)的是阿爾茨海默病的發(fā)生與腦內(nèi)β樣淀粉酶斑塊異常沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)和選擇性神經(jīng)元缺失密切相關(guān)，其中β樣淀粉酶斑塊的異常沉積在發(fā)病過程中最為重要

4、。阿爾茨海默病病人淀粉樣前體蛋白（APP）和早老素-1（PS1）基因突變的代謝產(chǎn)物Aβ1-42是β樣淀粉酶斑塊的重要組成成分，同時(shí)其神經(jīng)毒性作用也介導(dǎo)了腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞的大量死亡。神經(jīng)發(fā)生是指神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)先祖細(xì)胞在誘導(dǎo)因素作用下產(chǎn)生新生神經(jīng)元的過程，成體腦區(qū)的神經(jīng)發(fā)生具有個(gè)體成長(zhǎng)的功能和治療的意義。阿爾茨海默病病人在β樣淀粉酶斑塊和年齡的雙重作用下腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生數(shù)量明顯減低，這也從某種意義上進(jìn)一步加劇了此病的發(fā)生。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（B

5、DNF）是一類在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元發(fā)生、分化和存活過程中起重要作用的蛋白質(zhì)，參與軸突可塑性的調(diào)節(jié)、神經(jīng)元分化和存活、神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)元損傷后的神經(jīng)發(fā)生。
　　基于以上論述我們驗(yàn)證，電針刺激“百會(huì)穴”通過減少腦內(nèi)β樣淀粉酶斑塊的異常沉積、上調(diào)BDNF表達(dá)并促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生實(shí)現(xiàn)對(duì)阿爾茨海默病的治療作用，完成從病理學(xué)表現(xiàn)到行為學(xué)表現(xiàn)的飛躍，從而為臨床治療阿爾茨海默病提供一種新的、簡(jiǎn)便的治療手段。本實(shí)驗(yàn)選用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型模擬人類

6、阿爾茨海默病完成對(duì)本實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)性研究。
　　實(shí)驗(yàn)一：阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建與鑒定
　　【目的】：構(gòu)建阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型并對(duì)模型構(gòu)建情況進(jìn)行評(píng)估鑒定
　　【方法】：2月齡的APP和PS1基因突變的雄性C57小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。2月齡正常健康雄性C57小鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1）兩組動(dòng)物分別于2月齡、7月齡和10月齡進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，監(jiān)測(cè)隨著月齡的推移實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間學(xué)

7、習(xí)和空間記憶功能的改變。2）兩組動(dòng)物分別于2月齡、7月齡和10月齡進(jìn)行免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色，每組動(dòng)物每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只，監(jiān)測(cè)隨著月齡的推移腦內(nèi)β樣淀粉酶沉積情況的變化。從病理學(xué)和神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)兩個(gè)方面驗(yàn)證阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建情況。
　　【結(jié)果】：水迷宮結(jié)果顯示：阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠于2月齡時(shí)與對(duì)照組野生型C57小鼠相比其空間學(xué)習(xí)和記憶功能無顯著差異。于7月齡時(shí)，阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能明顯低于同月齡

8、對(duì)照組小鼠（P<0.05），10月齡時(shí)此種神經(jīng)行為學(xué)損傷表現(xiàn)進(jìn)一步加重。同時(shí)，與神經(jīng)行為學(xué)結(jié)果相一致的是，免疫組織化學(xué)雙重染色結(jié)果顯示阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)海馬和皮層部位β樣淀粉酶的沉積于2月齡時(shí)與對(duì)照組相比無明顯差異。于7月齡和10月齡時(shí)沉積量明顯增加。說明此小鼠于7個(gè)月齡時(shí)發(fā)生了明顯的空間學(xué)習(xí)記憶功能缺失和β樣淀粉酶的大量異常沉積，也即發(fā)生了阿爾茨海默病。于10月齡時(shí)，此神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)缺損和Aβ的異常大量沉積有增加趨勢(shì)。
　

9、　【結(jié)論】：阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建成功，可用于后續(xù)阿爾茨海默病治療方法的進(jìn)一步探討。
　　實(shí)驗(yàn)二：EA刺激對(duì)阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠病理學(xué)及神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)的影響
　　【目的】：探討電針刺激“百會(huì)穴”對(duì)阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ異常沉積和神經(jīng)行為學(xué)缺損的影響。
　　【方法】：實(shí)驗(yàn)分組：將48只雄性阿爾茨海默病小鼠隨機(jī)分為兩組：電針治療組（APP+EA組）和對(duì)照組（APP組）（n=24）；將48只健康雄性C57

10、小鼠隨進(jìn)分為兩組：電針治療組（Con+EA組）和對(duì)照組（n=24）。1）研究電針刺激對(duì)阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能的影響。電針刺激部位選取小鼠耳緣前線中點(diǎn)“百會(huì)穴”，刺激參數(shù)為強(qiáng)度1mA、頻率2/15HZ、疏密波，30分鐘/天、5天/星期，共刺激28天。電針刺激過程中使小鼠肛溫保持在37.0±0.5℃，面罩給氧流量為1L/min。電針刺激后次日行水迷宮測(cè)試檢測(cè)小鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)。2）研究電針刺激對(duì)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)Aβ沉

11、積的影響。水迷宮測(cè)試完畢后取腦行免疫組織化學(xué)雙重染色、Elisa和Westernblot檢測(cè)EA刺激對(duì)腦內(nèi)Aβ表達(dá)水平的影響。
　　【結(jié)果】：1）電針刺激后水迷宮結(jié)果顯示，與APP組相比，APP+EA組小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能缺損顯著改善，表現(xiàn)為目標(biāo)象限時(shí)間的延長(zhǎng)和平均逃避潛伏期的縮短（P<0.05）。同時(shí)，Con+EA組與Con組相比其空間學(xué)習(xí)和記憶功能的缺損也表現(xiàn)出了輕微的改善（P<0.05）。而APP組和APP+EA組小鼠的神

12、經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)較對(duì)應(yīng)的Con組和Con+EA組為差。2）免疫組織化學(xué)雙重染色將Aβ的表達(dá)定位于海馬和皮層部位神經(jīng)元的胞質(zhì)內(nèi)，其在APP+EA組小鼠腦內(nèi)的表達(dá)水平較APP組為底，在Con+EA組小鼠腦內(nèi)的表達(dá)較Con組為低。與相應(yīng)的對(duì)照組比較，定量檢測(cè)方法ELISA和Westernblot的結(jié)果也顯示EA刺激明顯降低了阿爾茨海默病小鼠和健康小鼠腦內(nèi)Aβ的表達(dá)水平（P<0.05）。
　　【結(jié)論】：電針刺激改善了阿爾茨海默病小鼠的神經(jīng)行為

13、學(xué)缺損、降低了腦內(nèi)Aβ的表達(dá)水平，對(duì)阿爾茨海默病具有明顯的治療作用。
　　實(shí)驗(yàn)三：EA刺激對(duì)阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠治療作用的機(jī)制研究
　　【目的】：探討電針刺激對(duì)阿爾茨海默病小鼠產(chǎn)生治療作用的相關(guān)機(jī)制。
　　【方法】：實(shí)驗(yàn)分組同前。1）研究電針刺激對(duì)小鼠BDNF表達(dá)的影響。各組小鼠于水迷宮測(cè)試后行多聚甲醛灌注固定，取腦后進(jìn)行冰凍切片免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色，觀察BDNF與神經(jīng)元的共定位情況。同時(shí)，海馬和皮層部位的新鮮腦組

14、織研碎后提取全蛋白行Westernblot分析，定量檢測(cè)腦內(nèi)BDNF的表達(dá)水平。2）研究電針刺激對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生數(shù)量的影響。各組小鼠處死前35天起腹腔注射100mg/kg/day的新生神經(jīng)元DNA標(biāo)記物5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）連續(xù)7天。最后一次注射藥物后28天行灌注取腦并行冰凍切片，免疫組織化學(xué)雙重染色標(biāo)記新生神經(jīng)元。
　　【結(jié)果】：1）免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BDNF與神經(jīng)元具有共定位現(xiàn)象。Westernblot檢測(cè)

15、發(fā)現(xiàn)：與APP組相比，APP+EA組小鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)水平明顯增高（P<0.05）。同時(shí)，Con+EA組與Con相比，BDNF的表達(dá)也出現(xiàn)了水平增加的現(xiàn)象（P<0.05）。APP組和APP+EA組BDNF的表達(dá)水平均低于相應(yīng)的Con相和Con+EA組。2）與APP組相比，APP+EA組小鼠腦內(nèi)新生神經(jīng)元的數(shù)量明顯增加（P<0.05）。Con+EA組與Con相比，新生神經(jīng)元的發(fā)生數(shù)量也出現(xiàn)了增加的現(xiàn)象（P<0.05）。
　　【結(jié)