超嗜熱古菌Thermococcus siculi HJ21產(chǎn)高溫普魯蘭酶的研究.pdf

1、普魯蘭酶(Puuulanase，EC3.2.1.41)是一種能夠?qū)Ｒ恍郧虚_(kāi)支鏈淀粉分支點(diǎn)中的α-1，6-糖苷鍵，從而剪下整個(gè)側(cè)支，形成直鏈淀粉的解支酶。它在淀粉加工工業(yè)中有著非常重要的用途，可大規(guī)模地提高淀粉的利用率和生產(chǎn)效率。普魯蘭酶可以單獨(dú)使用，亦可與其它酶配合使用，相輔相成收到良好的效果。當(dāng)前已較成熟地應(yīng)用于高葡萄糖漿、高麥芽糖漿和干啤酒生產(chǎn)中。 本文主要研究T.siculiHJ21的發(fā)酵條件優(yōu)化、酶學(xué)性質(zhì)以及酶基因的克隆

2、并在大腸桿菌中表達(dá)了該基因，為普魯蘭酶的蛋白質(zhì)工程提供理論基礎(chǔ)，并為該酶的高效表達(dá)和以后的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 研究了T.siculiHJ21高溫普魯蘭酶的發(fā)酵條件。該菌所產(chǎn)的普魯蘭酶為胞外酶，該菌株發(fā)酵18h后到達(dá)產(chǎn)酶高峰，產(chǎn)酶溫度范圍為60℃-90℃，其最適產(chǎn)酶溫度為88℃。產(chǎn)酶pH范圍為5.0-9.0，最適產(chǎn)酶pH為6.5。確定了最佳培養(yǎng)基配比為：0.7％(w/v)蛋白胨、0.7％(w/v)酵母粉、0.5％(w/v)麥芽糖和2.

3、5％(w/v)NaCl，最適發(fā)酵條件下可得到的最大產(chǎn)酶水平為14.8U/L。 研究了T.siculiHJ21高溫普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)。在pH6.0條件下，該菌株所產(chǎn)普魯蘭酶的最適作用溫度為95℃，在90℃-100℃范圍內(nèi)，酶活性變化不大；普魯蘭酶的最適作用pH為6.0，且在pH為5.0-7.0范圍內(nèi)，該酶都具有較高的活性；該酶的熱穩(wěn)定性較好，100℃保溫2h，仍有50％以上的殘余酶活，在100℃保溫0.5h，殘余酶活約為72％；在

4、95℃下保溫4h后，普魯蘭酶在pH5.0-7.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定，殘余酶活力保持在70％以上；在pH6.5時(shí)，普魯蘭酶的穩(wěn)定性最好；Ca2+和Na+對(duì)酶活性有不同程度的激活作用；Al3+、Ni2+、Hg2+、Cu2+對(duì)酶活有較為顯著的抑制作用；低濃度的尿素和SDS對(duì)普魯蘭酶沒(méi)有明顯的作用；EDTA、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精γ-環(huán)糊精均對(duì)酶具有顯著的抑制作用。 根據(jù)NCBI中已報(bào)道的超高溫古菌產(chǎn)高溫普魯蘭酶的基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)擴(kuò)

5、增和序列拼接獲得了ORF大小為4056bp的高溫普魯蘭酶的基因，可編碼1351個(gè)氨基酸，具有27個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。通過(guò)測(cè)定普魯蘭酶基因的序列，經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因與T.hydrothermalis的耐高溫普魯蘭酶親緣關(guān)系最近，堿基序列的同源性達(dá)到82％以上，氨基酸序列的同源性達(dá)到87％。 構(gòu)建了N端具有His6標(biāo)簽的表達(dá)載體。pET-28a-pull。含有表達(dá)載體pET-28a-pull的E。coliBL21(DE3)