豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)分析及其突變體致病性.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科，基因組全長為1768nt或1767nt，除ORF1和ORF2兩大閱讀框外，還潛在9個(gè)ORFs。ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，ORF2編碼PCV2免疫相關(guān)的蛋白Cap.PCV2是引起PMWS的主要病原，主要表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)的損傷，使感染豬處于嚴(yán)重免疫抑制狀態(tài)。本課題主要進(jìn)行了PCV2的血清流行病學(xué)，分子流行病學(xué)和基因組各閱讀框的致病性等方

2、面的研究。 應(yīng)用無PCV污染的PK-15細(xì)胞分離病毒，從浙江省境內(nèi)11個(gè)地市分離獲得10株P(guān)CV2病毒。分離的病毒株經(jīng)超速密度梯度離心純化后，電鏡下可觀察到直徑17-20nm的病毒粒子；分離病毒株的核苷酸測序結(jié)果顯示，所用分離株的基因組長度均為1767bp。 應(yīng)用IFA技術(shù)，對浙江省內(nèi)11個(gè)不同地區(qū)104個(gè)規(guī)模化豬場2000-2004年期間的4,307個(gè)血清樣本進(jìn)行PCV2的血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查，通過對不同地區(qū)、年份、年齡

3、和品種豬的血清學(xué)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，所檢測浙江省豬場均存在PCV2感染，豬群PCV2感染率為68.10％，種豬感染的血清陽性率為66.88％，斷奶后豬感染的血清陽性率為82.10％。長白種豬感染的血清陽性率為44.83％、長白仔豬PCV2感染的血清陽性率為64.28％，明顯高于大約克和杜洛克的種豬和仔豬。PCV2感染的血清陽性率高的種豬和仔豬群，其PRRSV和PRV的抗體陽性率低。通過對未免疫PRRSV疫苗的豬場進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PC

4、V2感染率高的豬群，其PRRSV的感染率也隨之升高。這些結(jié)果說明PCV2在豬群中的感染非常普遍，不同品種豬對PCV2的易感性不同，PCV2的感染降低了豬群對疫苗的免疫應(yīng)答，PCV2的感染增加了PRRSV感染水平。 以IFA和IPMA技術(shù)，對2004-2005年2,352份人血清與2005年奶牛、雞、鴨、和山羊血清進(jìn)行PCV2相關(guān)抗體的血清學(xué)檢測，在689份人血清中檢測到PCV2相關(guān)抗體，PCV2相關(guān)抗體陽性率為29.3％，沒有在

5、奶牛、雞、鴨、和山羊中檢測到PCV2相關(guān)抗體的存在。數(shù)據(jù)分析表明：2005年人群中PCV2的陽性率顯著高于2004年(p<0.01)；不同地區(qū)PCV2相關(guān)抗體陽性率差異不顯著性(p>0.05)；40至49年齡段人群抗體陽性率最高(OR=1.390[95％CI，1.011-1.910]，p=0.042)，女性的陽性率高于男性；PCV2相關(guān)抗體陽性率與HBV感染和ALT水平的升高不存在相關(guān)性。 根據(jù)PCV2-HZ0201株序列設(shè)計(jì)引

6、物，擴(kuò)增HZ0201的全基因組和各ORF突變?nèi)蚪M，構(gòu)建PCV2-HZ0201正常、ORb3和ORF4雙突變(PCV2-MF3/4)、ORF5至11單ORF突變(PCV2-MF5至11)等基因組的重組質(zhì)粒；將實(shí)驗(yàn)室保存的PCV2-MF3和PCV2-MF4與本研究中構(gòu)建重組質(zhì)粒中的PCV2全基因酶切，環(huán)化后轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)6次傳代。PCV2正常的感染性克隆、PCV2-MF3、MF4、MF5、MF9、MF10和MF11

7、在轉(zhuǎn)染后和傳代后均能夠用PCR和IFA檢測到PCV2病毒的存在，測序分析顯示突變位點(diǎn)仍然存在； TCID<,50>測定結(jié)果顯示與野毒株相比未見明顯差異，而ORb3-ORF4、ORF6、ORF7和ORF8缺失后則不能檢測到病毒抗原和核酸存在。這些結(jié)果表明，ORb3-ORF4、ORF6、ORF7和ORF8或其突變點(diǎn)可能與病毒的復(fù)制有關(guān)；而ORF5、ORF9、ORF10、和ORF11或其突變點(diǎn)與病毒的復(fù)制無關(guān)。將PCV2-HZ0201

8、、正常感染性克隆(IC)及突變體(PCV2-MF3至5、PCV2-MF9-11)，腹腔和鼻內(nèi)接種8周齡：BALB/c小鼠，研究突變后的PCV2對小鼠致病性變化。PCV2-HZ0201、IC、PCV2-Mb3和PCV2-MF4組，在7-14天出現(xiàn)抗體，28天左右抗體水平最高，隨后開始下降；PCV2-MF5、PCV2-MF9至11接種后14-21天出現(xiàn)抗體，35天左右抗體水平最高，隨后開始下降。PCV2-HZ0201，IC，PCV2-MF4

9、、PCV2-MF9和PCV2-MF10通過Caspase-3和Caspase-8途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，感染后21天脾臟凋亡細(xì)胞數(shù)顯著上升，CD3<'+>CD4<'+>、CD4<'+>CD8<'+>和CD3<'+>CD8<'+>T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著下降，病理切片可觀察到淋巴細(xì)胞缺失和凋亡現(xiàn)象，并出現(xiàn)病毒血癥；感染后42天有所恢復(fù)。PCV2-MF3和：PCV2-MF5接種小鼠后未誘導(dǎo)脾臟內(nèi)凋亡細(xì)胞水平升高，和CD3+CD4+、CD4+CD8+和C

10、D3+CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著降低，大部分小鼠切片未觀察到明顯病理變化和病毒血癥。PCV2-MF11感染小鼠后21天未顯著誘導(dǎo)脾臟細(xì)胞凋亡和降低CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量；但感染后42天顯著降低CD3<'+>CD4<'+>和CD3<'+>CD8<'+>T淋巴細(xì)胞數(shù)量，并出現(xiàn)病毒血癥和脾臟淋巴細(xì)胞缺失現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，ORF3，ORF5和ORF11突變后部分的改變了PCV2的致病性，可能存在于PCV2基因組中，是