高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及分子流行病學(xué)分析.pdf

1、為了弄清2006年在我國南方一些豬場爆發(fā)的一種以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的傳染病的病因，本研究中我們選取了8份發(fā)病豬的臨床樣品，利用豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的ORF7和ORF5基因的特異性引物進(jìn)行了PRRSV的檢測，結(jié)果顯示8份樣品中有7份呈現(xiàn)PRRSV陽性，利用Marc-145細(xì)胞對7份組織樣品進(jìn)行病毒的分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離獲得的病毒細(xì)胞適應(yīng)能力強(qiáng)，病變的細(xì)胞主要表現(xiàn)為聚集呈叢狀，對分離的病毒進(jìn)行RT-PCR鑒定、外源

2、病毒排查以及間接免疫熒光試驗(yàn)等證實(shí)我們分離獲得的毒株為PRRSV毒株，命名為HUN4株。對HUN4株進(jìn)行了全長基因序列測定結(jié)果顯示基因組全長15352bp，其中HUN4株的NSP2蛋白與經(jīng)典毒株CH-1a株和VR-2332等相比在第482位和533-561位氨基酸發(fā)生30個(gè)氨基酸的缺失，屬于新的變異的PRRSV毒株。對HUN4株進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，結(jié)果表明試驗(yàn)豬發(fā)病率和死亡率均高達(dá)100％，感染豬的臨床癥狀和現(xiàn)地所見十分相似，在感染后第7

3、天就可檢測到高水平的血清抗體，組織病理變化較以往毒株嚴(yán)重，致死能力強(qiáng)；表明2006年以來在我國流行的PRRSV具有明顯的毒力增強(qiáng)現(xiàn)象，這種高致病性PRRSV可能是引起豬“高熱綜合征”的主要病因。 在以上研究的基礎(chǔ)上，我們利用ORF5基因和NSP2部分基因的特異性引物對2006年～2008年來自全國16個(gè)省市的339份患病豬組織樣品進(jìn)行分子流行病學(xué)監(jiān)測，并對其中部分樣品的GP5和NSP2基因進(jìn)行了序列分析。結(jié)果表明，被檢樣品的陽性

4、率達(dá)43.1％；對64份陽性樣品的序列分析結(jié)果表明有56株為高致病性PRRSV變異毒株，即NSP2蛋白在482aa和533-561aa出現(xiàn)兩處不連續(xù)的缺失；其余8株未發(fā)生此種缺失。對GP5蛋白氨基酸序列分析結(jié)果顯示N-糖鏈數(shù)量增多、位置改變，主要中和表位存在氨基酸變異(L39→I39)，在13位和151位與毒力相關(guān)的位點(diǎn)保持了強(qiáng)毒株的氨基酸特性(R13、R151)。繪制系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹結(jié)果顯示國內(nèi)分離株主要分為4個(gè)亞群，其中所有高致病性P

5、RRSV毒株高度同源，均位于亞群Ⅰ，8株非變異株主要分布在亞群Ⅱ中，變異株所處的亞群Ⅰ與經(jīng)典分離株、疫苗株所處的其它亞群之間的同源性較低，其親緣關(guān)系由近及遠(yuǎn)依次為亞群Ⅱ、亞群Ⅲ、亞群Ⅳ。 為了有效地鑒別高致病性PRRSV株與經(jīng)典PRRSV株，參考GenBank發(fā)表的經(jīng)典PRRSV株及本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的高致病性PRRSVHUN4株的NSP2基因序列，在NSP2基因缺失區(qū)的兩端保守區(qū)設(shè)計(jì)并合成了一對引物，擴(kuò)增高致病性PRRSV時(shí)可獲

6、得230bp的片段，而擴(kuò)增經(jīng)典型PRRSV時(shí)可獲得320bp的片段，通過RT-PCR擴(kuò)增片段長度可將二者區(qū)分開來，特異性試驗(yàn)表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物可擴(kuò)增出PRRSV目的片段，而不能擴(kuò)增PCV2、PRV和CSFV基因組片段；將毒價(jià)為105.0TCID50/ml的HUN4株進(jìn)行10倍倍比稀釋，直到1TCID50，用RT-PCR檢測結(jié)果表明對PRRSV最小檢出量為10TCID50；選取56份已知的臨床樣品和5份人工感染試驗(yàn)樣品進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)