厚樸遺傳多樣性和遺傳關(guān)系研究及ITS序列分析.pdf

1、厚樸（Magnolia officinalisRehd．et Wils）屬木蘭科（Magnoliaceae）木蘭屬（Magnolia）落葉喬木，被列為國家二級瀕危保護(hù)植物。因其種類原始、分類地位特殊，且藥用價(jià)值極高，而備受關(guān)注。隨著社會對其需求量的增加，受利益的驅(qū)使，人們大量盜挖野生厚樸資源，致使目前其野生種群的數(shù)目和規(guī)模都在不斷變小，呈散生狀態(tài)，生境逐漸片斷化，自然種群間的基因交流受阻，生存現(xiàn)狀令人擔(dān)憂，開展厚樸種群相關(guān)研究已迫在眉睫

2、。
　　本文利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對厚樸種群遺傳多樣性和遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，探索厚樸種群的遺傳多樣性及地域遺傳分化，從分子水平揭示其瀕危的原因，并提出相應(yīng)保護(hù)策略；同時(shí)本文還利用ITS序列分析技術(shù)對11個(gè)主產(chǎn)區(qū)的厚樸ITS序列堿基變異進(jìn)行了研究，為產(chǎn)區(qū)間厚樸的引種及道地性鑒定提供分子方面的證據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）厚樸基因組DNA提取方法研究結(jié)果
　　運(yùn)用SDS-CTAB結(jié)合法、SDS法、CTAB法及高鹽低p

3、H法對厚樸基因組DNA進(jìn)行提取，以SDS-CTAB結(jié)合法效果最佳，特別是高濃度NaAc的引入及相應(yīng)凍融，可明顯提高所得厚樸基因組 DNA純度；同時(shí)采用石英砂和4％ PVP溶液代替液氮研磨葉片，也可達(dá)到較好效果。
　?。?）ISSR引物篩選及條件優(yōu)化研究結(jié)果
　　通過正交試驗(yàn)確定了影響厚樸 ISSR-PCR反應(yīng)的各項(xiàng)參數(shù)。其中擴(kuò)增體系為：引物濃度0.3μmol?L-1，Taq酶0.04 U?μl-1，DNA濃度4 ng?μl-

4、1，Mg2+與dNTP濃度分別為1.5和0.2 mmol?L-1；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50℃～60℃（退火溫度隨引物不同而定）退火45 s，72℃延伸90 s，共40個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸8 min，4℃終止反應(yīng)。最后，還利用該體系成功篩選出21條可用于厚樸遺傳多樣性及遺傳關(guān)系研究的ISSR引物。
　?。?）不同產(chǎn)區(qū)厚樸ITS序列分析結(jié)果
　　對11個(gè)產(chǎn)區(qū)厚樸ITS序列分析發(fā)現(xiàn)，厚樸ITS

5、全序列長度介于593～600bp（不考慮Gap，ITS1序列長度為214～217bp，ITS2序列長度為215～219bp，5.8S rDNA編碼區(qū)極為保守，片段長度為164bp），并有33個(gè)變異位點(diǎn)（Gap做缺失處理，全部發(fā)生在ITS1和ITS2序列），且堿基頻率及含量也呈現(xiàn)一定的變化（ITS1和ITS2序列GC含量分別為54.42%～55.35%和59.82%～60.95%，5.8S無變化，為46.95%）；遺傳距離和聚類分析顯示出

6、部分厚樸產(chǎn)區(qū)間的親緣關(guān)系，反映了我國厚樸全國引種栽培的現(xiàn)狀。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)產(chǎn)區(qū)間厚樸ITS序列位點(diǎn)變異與其葉形的變化不存在必然聯(lián)系。
　?。?）厚樸種群遺傳多樣性及遺傳關(guān)系分析結(jié)果
　　利用ISSR標(biāo)記對28個(gè)厚樸種群666個(gè)個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，開展厚樸遺傳多樣性及遺傳關(guān)系研究，結(jié)果表明，12條ISSR引物均能在所有個(gè)體中穩(wěn)定擴(kuò)增，共擴(kuò)增出137條帶，其中114條為多態(tài)性條帶，多態(tài)位點(diǎn)百分比（PPB）介于75.00%-91.67%；厚

7、樸在物種水平擁有較高的遺傳多樣性（PPB=83.21%，H=0.342），而在種群水平遺傳多樣性卻相對較低（PPB=49.76%，H=0.194），這可能與厚樸形成的特殊歷史原因有關(guān)；28個(gè)厚樸種群間遺傳多樣性指標(biāo)呈現(xiàn)差異，但各種群間的遺傳多樣性指標(biāo)均與海拔、經(jīng)緯度的變化無關(guān)（Pearson correlation test，P＞0.05）；28個(gè)厚樸種群間已經(jīng)產(chǎn)生一定程度的分化，且種群內(nèi)的遺傳分化大于種群間（GST=0.4278）。A

8、MOVA（Analysis of molecular variance）分析結(jié)果與其相吻合，并且表明厚樸種群間和種群內(nèi)均發(fā)生了顯著的遺傳分化（AMOVA analysis，P<0.001）；基于Nei遺傳距離進(jìn)行的NJ聚類，28個(gè)厚樸種群明顯的被分為3組，與Structure遺傳結(jié)構(gòu)分析及主坐標(biāo)分析（PCoA，2Dim and3Dim）結(jié)果相吻合；基于種群地理距離自然對數(shù)和遺傳距離的Mantel檢測表明，厚樸種群的遺傳分化（R=-0.0