藥用苦楝遺傳多樣性ISSR分析和遺傳變異規(guī)律研究.pdf

1、苦楝(Melia azedaeach L.)是我國(guó)優(yōu)良的鄉(xiāng)土樹種，在我國(guó)分布廣泛。作為一種植物源農(nóng)藥原料樹種，其提取物具有廣譜、高效、低毒、無(wú)殘留、對(duì)靶標(biāo)生物具有強(qiáng)力選擇性等特點(diǎn)，具有獨(dú)特殺蟲作用，而對(duì)環(huán)境幾乎沒有污染。在我國(guó)苦楝資源豐富，但大多數(shù)散生，天然林較少，保護(hù)苦楝現(xiàn)有資源，開發(fā)和利用以苦楝為原料的植物源農(nóng)藥已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。 本研究從遺傳多樣性和遺傳變異兩方面分別對(duì)我國(guó)南方苦楝的遺傳多樣性和福建苦楝的遺傳變異進(jìn)行研

2、究。運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析南方不同種源間苦楝的遺傳多樣性，地理差異對(duì)苦楝遺傳分化的影響以及苦楝不同種源間的親緣關(guān)系等；對(duì)福建的苦楝資源進(jìn)行了細(xì)致的調(diào)查選優(yōu)，篩選出藥用含量高的苦楝優(yōu)樹，分析了福建苦楝的種子表型變異、川楝素含量變異、營(yíng)養(yǎng)變異以及氣象因子對(duì)三者的影響等。本研究得到以下結(jié)論： 1、建立了重復(fù)性和穩(wěn)定性較好的PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性94℃，5min；變性94℃，45s；退火溫度與每個(gè)引物相對(duì)應(yīng)，退火45s；延伸72℃

3、，90s；40個(gè)循環(huán)；后延伸72℃，10min；4℃保存，擴(kuò)增結(jié)束。采用單因素和正交試驗(yàn)兩種方法篩選PCR反應(yīng)體系，最終確立了適用于13個(gè)種源苦楝的最優(yōu)ISSR-PCR反應(yīng)體系：dNTP濃度0.40mmol/L、Taq DNA聚合酶濃度1.00U、引物濃度0.80μmol/L、Mg2+濃度3.00mmol/L、模板DNA濃度50ng，總反應(yīng)體積為20μl。 2、從100個(gè)ISSR引物中經(jīng)反復(fù)篩選，最終選擇了24個(gè)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)

4、定性好、多態(tài)性高的ISSR引物應(yīng)用于苦楝遺傳多樣性研究。24個(gè)ISSR引物對(duì)13個(gè)種源苦楝優(yōu)樹DNA總共擴(kuò)增出382個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為98.43％，其中廣西南寧(NN)和福州倉(cāng)山(CS)的多態(tài)位點(diǎn)百分率最高，為54.97％，福建延平(YP)的多態(tài)位點(diǎn)百分率最低，為43.98％，說明13個(gè)種源苦楝的遺傳多樣性豐富。 3、13個(gè)種源苦楝DNA的有效等位基因數(shù)(Ne)的變異幅度為1.3110-1.3887，Nei's基因多樣性指

5、數(shù)(H)的變異幅度為0.1822-0.2277和Shannon多樣性指數(shù)(I)的變異幅度為0.2660-0.3324，多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)的變異幅度為43.98-54.97，說明地理因素是造成不同種源間苦楝遺傳多樣性豐富的主要因素之一。海南種源的遺傳分化系數(shù)(Gst)最高，為0.4394；廣西的最低，為0.2899；基因流(Nm)變異幅度為0.6379-1.2247，且地理微環(huán)境引起的種源內(nèi)變異均在55％以上，比種源間遺傳變異大，說

6、明地理微環(huán)境的變化對(duì)苦楝的遺傳分化也有著較大影響。 4、13個(gè)種源苦楝的Nei's(1978)遺傳距離為0.0012-0.2840，經(jīng)UPGMA聚類分析，13個(gè)種源苦楝可分為4類：第Ⅰ類為云南保山(BS)；第Ⅱ類為四川綿陽(yáng)(MY)、廣西南寧(NN)、海南昌江(CJ)、福建永泰(YT)、湖南瀏陽(yáng)(LY)、廣西龍泉(LQ)、福州倉(cāng)山(CS)；第Ⅲ類為福建明溪(MX)；第Ⅳ類為浙江金華(JH)、福建延平(YP)、福建建甌(JO)、福建

7、尤溪(YX)。從總體上來(lái)看，13個(gè)苦楝種源可以分為兩大類，即云南保山為一大類，其他種源為另一大類。 5、運(yùn)用U7(73)三因素七水平均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)溶劑濃度、提取時(shí)間和提取溫度等影響苦楝川楝素提取的主要因素進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇濃度對(duì)川楝素提取影響最顯著。在7個(gè)處理組合中，第7個(gè)處理組合的提取效果最好，提取量達(dá)4.259mg·g-1，即最優(yōu)提取組合方式為75％乙醇，提取溫度(水浴)50℃，提取時(shí)間為50min。 6、福建

8、省32個(gè)地區(qū)的99株候選苦楝優(yōu)樹，川楝素測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)不同部位的川楝素含量存在較大差異，其中枝葉的川楝素含量為0.0314-0.8105mg·kg-1，皮的川楝素含量為0.1600-5.9931mg·kg-1，果實(shí)的川楝素含量為0.4213-8.9917 mg·kg-1，而果實(shí)川楝素的總平均含量均高于枝葉和皮的含量。根據(jù)不同部位川楝素含量，通過聚類分析，將99株候選優(yōu)樹劃分為四類，其中德化FK4、沙縣FK53、邵武FK57、壽寧FK62、

9、順昌FK63、仙游FK74、永春FK84、永泰FK89、尤溪FK90是選出的高川楝素含量的苦楝優(yōu)樹。東經(jīng)、北緯、海拔、年均溫和年均降雨量是影響川楝素含量的主要?dú)庀笠蜃樱?個(gè)氣象因子的累積貢獻(xiàn)率達(dá)86.562％，但總體上看，氣象因子對(duì)川楝素含量的影響并不顯著。 7、32個(gè)種源苦楝種子表型性狀長(zhǎng)、寬、平均單粒重均存在極顯著性差異，種子表型較為豐富；種子表型性狀變異系數(shù)均值大小順序是：寬>長(zhǎng)>平均單粒重，表型性狀在不同種源間存在著一定

10、的變異幅度，但氣象因子對(duì)種子表型性狀的變異影響并不顯著；種子長(zhǎng)和寬，是苦楝種子表型性狀的主要性狀，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)98.14％。 8、福建32個(gè)種源苦楝N、P、K含量存在較大差異，大小順序依次為N>K>P。不同種源間苦楝營(yíng)養(yǎng)元素含量差異性達(dá)到了極顯著水平，說明不同種源苦楝在吸收和利用營(yíng)養(yǎng)元素的能力上存在顯著差異。氣象因子對(duì)苦楝N、P、K含量總體上影響不明顯，僅葉的N、K含量分別與種源地的極低溫度和極高溫度之間呈顯著相關(guān)性，且葉中N的