海參養(yǎng)殖池微生物多樣性及其動態(tài)研究.pdf

1、海參養(yǎng)殖業(yè)是我國特色海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)之一，主要分布在遼寧和山東沿海。海參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，2010年全國海參養(yǎng)殖面積已達到萬公頃，產(chǎn)量達萬噸，產(chǎn)值接近億元。然而，相對于其迅速發(fā)展的規(guī)模，與海參養(yǎng)殖技術(shù)相關(guān)的基礎(chǔ)研究還比較滯后。因此，相關(guān)基礎(chǔ)研究越來越受到人們的重視。
　　海參養(yǎng)殖環(huán)境中微生物有著十分重要的地位，大部分微生物以生產(chǎn)者或分解者作用參與水生生態(tài)系統(tǒng)，部分寄生或共生型病原微生物會造成海參疾病爆發(fā)，與海參的健康生長有著十分緊密的聯(lián)

2、系。而在人工養(yǎng)殖過程中，不規(guī)范的投放餌料、藥物濫用等造成池底物質(zhì)堆積，往往會導(dǎo)致水體微生態(tài)平衡受到嚴重破壞，水質(zhì)惡化、缺氧等，造成海參免疫力下降或死亡;另外，水體富營養(yǎng)化也會造成水體優(yōu)勢青苔與養(yǎng)殖生物餌料藻類競爭，造成底質(zhì)腐敗等，進而給海參養(yǎng)殖造成直接或間接的負面影響。因此，海參養(yǎng)殖環(huán)境的健康狀況與微生物群落的豐度、群落結(jié)構(gòu)有著緊密的聯(lián)系，探究養(yǎng)殖環(huán)境中微生物群落的組成與動態(tài)變化對于海參養(yǎng)殖業(yè)具有重要的理論和實踐意義。
　　基于以

3、上背景，本工作對海參養(yǎng)殖池塘中的微生物多樣性和年度動態(tài)變化進行了研究，采用流式細胞術(shù)檢測水體中浮游微生物豐度;通過高通量測序檢測真菌、古菌、細菌等不同類型的微生物多樣性及其豐度變化;利用連續(xù)流動分析儀對海參養(yǎng)殖水體的環(huán)境因子進行測定;綜合群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境因子尋找影響微生物群落變化的制約性因素。另外，針對青苔爆發(fā)頻繁的實際性問題，利用特異性引物設(shè)計和定量PCR技術(shù)相結(jié)合，探討檢測海參養(yǎng)殖池中青苔孢子的分子檢測方法，以期達到對青苔爆發(fā)的早期預(yù)

4、警。本研究旨在為海參養(yǎng)殖池塘環(huán)境微生物生態(tài)調(diào)控模式的建立提供一定的基礎(chǔ)資料。主要研究結(jié)果如下:
　　1.海參養(yǎng)殖池浮游微生物的分布
　　利用流式細胞儀技術(shù)研究了海參養(yǎng)殖池塘水體環(huán)境浮游微生物豐度變化及其與環(huán)境因子的關(guān)系。
　　結(jié)果表明:
　　(1)浮游微生物檢測出聚球藻、皮微級浮游植物、納微級浮游植物、隱藻、高低核酸異養(yǎng)細菌幾大類型，其中細菌數(shù)量級非常大，幾乎達到106/mL，而浮游植物的數(shù)量級較小，只有102/

5、mL～103/mL。
　　(2)浮游微生物一般都是3月開始生長，到6月份處于爆發(fā)頂峰期，9月份的時候已經(jīng)處于衰退期。
　　(3)浮游微生物數(shù)量與環(huán)境中的溶解氧，鹽度、pH、可溶性總氮具有一定的相關(guān)關(guān)系，其中，溶解氧和pH對于浮游微生物的影響是最大的。
　　2.海參養(yǎng)殖池微生物多樣性分析
　　水樣過濾膜提取DNA，并進行高通量測序，再結(jié)合環(huán)境因子對比，研究海參養(yǎng)殖池微生物多樣性。
　　結(jié)果表明:
　　(

6、1)細菌中變形菌門是重要組成部分，其中α-變形菌（Alphaproteobacteria）是主要類群。CCA分析結(jié)果顯示，原核生物類群受pH、亞硝態(tài)氮、硅、氨態(tài)氮、溫度控制。
　　(2)古菌生物中，大部分樣品優(yōu)勢類群是DHVEG-6。而且大部分古菌如DHVEG6、MHVG、GroupC3、MBGB等都與各種形態(tài)可溶性氮元素有著顯著甚至是極顯著相關(guān)性。CCA分析的結(jié)果顯示出微生物群落受鹽度和硅控制。
　　(3)真核微生物中泛植

7、物界占據(jù)主要組成部分，而在泛植物界中綠藻門是最主要的。CCA結(jié)果顯示生物類群受鹽度、溫度、pH、溶解氧、亞硝態(tài)氮、氮磷比控制影響。
　　3.海參養(yǎng)殖池三種藻類孢子/配子qPCR檢測
　　對海參養(yǎng)殖池三種爆發(fā)性青苔進行了18S和ITS區(qū)間測序，設(shè)計了以核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)為靶區(qū)域的種類特異性PCR引物，通過藻類和環(huán)境水樣DNA對照實驗檢驗其特異性和適用性。
　　結(jié)果如下:
　　(1)所得三種藻類ITS引物均具

8、有一定種類或類群特異性。
　　(2)三對引物在qPCR方法中呈現(xiàn)一定的靈敏度，三株藻類最低檢出限度:緣管石莼約1.66×10-4 ng/μL，200個ITS基因拷貝數(shù);未能鑒定到種約6.6×10-6 ng/μL，200個ITS基因拷貝數(shù);萱藻1.66×10-4 ng/μL，400個ITS基因拷貝數(shù)。
　　(3)使用qPCR方法對煙臺海參養(yǎng)殖水體6個季度環(huán)境水樣中的萱藻孢子/配子進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)樣品中萱藻孢子/配子ITS拷貝