熱泉微生物及其氫酶多樣性研究.pdf

1、深海熱液和淺海熱泉是嗜熱氫酶最主要的發(fā)源地。微生物發(fā)酵是氫氣生產(chǎn)的一種重要技術(shù)，在深海熱液環(huán)境中產(chǎn)氫的微生物是嗜熱的和耐鹽的，目前已經(jīng)調(diào)查和研究的嗜熱環(huán)境均分布著嗜熱的氫還原或者氫氧化的細(xì)菌，因此熱泉仍然蘊(yùn)藏著大量未知的、有可能培養(yǎng)的產(chǎn)氫酶微生物。
　　本論文對(duì)印度洋卡利安達(dá)島海洋熱泉周邊的微生物群落進(jìn)行了分析，采集了熱泉周邊的海水樣品、菌苔和沉積物，通過(guò)擴(kuò)增構(gòu)建熱泉微生物的總16SrRNA基因庫(kù)，分析熱泉微生物的多樣性。結(jié)果表明

2、熱泉周?chē)煌瑯悠肪哂泻芨叩奈⑸镱惾憾鄻有裕蟛糠中蛄信c已知細(xì)菌16S rDNA序列相似性較高(88％~100%)，歸屬于變形細(xì)菌的α-變形菌綱、β-變形菌綱、δ-變形菌綱、γ-變形菌綱，壁厚菌門(mén)的梭菌綱、芽孢桿菌綱，脫鐵桿菌綱，疣微菌綱，藍(lán)細(xì)菌等系統(tǒng)分類群,其中變形細(xì)菌的γ-變形菌綱（占總克隆的41.88%）、β-變形菌綱（占總克隆的19.23%）、α-變形菌綱（占總克隆的8.97%）為熱泉周邊海水的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群。藍(lán)細(xì)菌的Chroob

3、acteria（占總克隆的55.29%）、擬桿菌門(mén)的擬桿菌綱（占總克隆的13.53%）、α-變形菌綱（占總克隆的10%）是菌苔微生物群落中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群。脫鐵桿菌綱（占總克隆的28.21%）、變形細(xì)菌的α-變形菌綱（占總克隆的12.85%）、γ-變形菌綱（占總克隆的10.03%）、β-變形菌綱（占總克隆的8.78%）、δ-變形菌綱（占總克隆的8.78%）是海洋熱泉沉積物的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群。
　　利用不同氫酶引物，以環(huán)境DNA為模板進(jìn)行

4、擴(kuò)增，構(gòu)建氫酶基因文庫(kù)，分析熱泉微生物氫酶的多樣性。利用三對(duì)引物以菌苔DNA和沉積物DNA為模板都得到了目的擴(kuò)增片段，對(duì)目的片段進(jìn)行回收連接轉(zhuǎn)化。以HydA?F/HydA?R為引物得到的基因庫(kù)，經(jīng)過(guò)比對(duì)，HKM樣品中得到了6個(gè)不同的基因型，HKS樣品中得到了4個(gè)不同的基因型，樣品HKM和樣品HKS所獲基因的覆蓋率分別是98.04%和97.62%，都與Ignavibacterium albumJCM16511FeFe氫酶類群的菌氨基酸序列

5、有75%-96%的相似性。Ignavibacterium album是在陸地溫泉的微生物藻床分離得到的嗜溫化學(xué)異養(yǎng)的細(xì)菌。這些FeFe氫酶類群的菌氨基酸序列之間的進(jìn)化關(guān)系在72%-99%。以FeFe-272F/FeFe-427R為引物得到的基因庫(kù)，經(jīng)過(guò)比對(duì)，泥樣有14種基因型，其覆蓋率為62.3%；菌苔（FeM）樣品中得到24個(gè)基因型，其覆蓋率達(dá)到65.2%。以HoxH-f/HoxH-r為引物得到的基因庫(kù)，結(jié)果得到菌苔樣品中有7種基因型

6、，其覆蓋率達(dá)到65%；泥樣樣品中有1種基因型，其覆蓋率為95%。
　　目前還沒(méi)有對(duì)利用Fe–Fe氫酶產(chǎn)氫的嗜熱菌環(huán)境的報(bào)道。本論文對(duì)從溫泉海藻床的幾個(gè)菌群利用全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，并對(duì)其產(chǎn)氫進(jìn)行分析。通過(guò)對(duì)16S rRNA基因分析得到了產(chǎn)氫群，并對(duì)富集菌群的Fe–Fe氫酶的多樣性進(jìn)行了分析?；?6S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析：在產(chǎn)氫菌群中有10個(gè)類群與梭菌屬（Clostridia）、Gammaproteobacteria

7、和芽孢桿菌目（Bacillales）中的的已知種屬有90-99.5%的相似性。梭菌屬是最多的的一組，其中有已知的產(chǎn)氫種屬三個(gè)梭菌類群（Anaerovorax odorimutans(94.0%相似性)，Clostridium papyrosolvens（98.4%相似性）和Clostridiumtepidiprofundi（93.1%相似性）。Fe–Fe氫酶系統(tǒng)發(fā)育分析：有7個(gè)類群和已知Fe–Fe氫酶有63-97%的相似性，分為不同的四