高氧對窒息新生大鼠肺部的影響及補(bǔ)充DHA的作用.pdf

1、目的：新生兒窒息在圍產(chǎn)兒中有較高的發(fā)生率，窒息后使用氧氣復(fù)蘇是最常用的方法。隨著對氧的認(rèn)識不斷提高，特別是高濃度氧可致早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)及慢性肺部疾病(CLD)等的發(fā)生，人們對新生兒出生窒息時是否該用純氧復(fù)蘇進(jìn)行了廣泛地討論，但尚未有定論。二十二碳六烯酸(DHA)屬長鏈多不飽和脂肪酸，對腦和視網(wǎng)膜的發(fā)育有十分重要的作用，近年來的研究發(fā)現(xiàn)DHA還具有抑制炎癥，提高機(jī)體抗氧化的作用。本課題的目的旨在通過動物實(shí)驗(yàn)研究高氧對窒息新生大鼠肺

2、部的影響及補(bǔ)充DHA的作用，主要做了以下的一些工作：(1).觀察母鼠孕期補(bǔ)充DHA的新生大鼠在出生時血漿中脂肪酸的成份與未補(bǔ)充DHA的新生大鼠血漿中脂肪酸成份的差異；(2).觀察和比較窒息新生大鼠在高氧復(fù)蘇時體內(nèi)的氧化和抗氧化因子的變化及母鼠孕期補(bǔ)充DHA對其的影響；(3).觀察和比較窒息新生大鼠在高氧復(fù)蘇時肺部過氧化物增殖激活受體-γ(PPAR-γ)的變化及補(bǔ)充DHA對其的影響；(4).觀察和比較窒息新生大鼠高氧復(fù)蘇時其肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)

3、纖維肌動蛋白的形態(tài)和肌動蛋白表達(dá)的變化及補(bǔ)充DHA對其的影響；(5).觀察和比較窒息新生大鼠高氧復(fù)蘇時肺部纖維化的病理改變及補(bǔ)充DHA的作用。 方法：36只成年雌性SD清潔級大鼠分批懷孕，母鼠從懷孕開始隨機(jī)進(jìn)入普食組(給予普通飼料)和補(bǔ)充DHA組(補(bǔ)充DHA100mg/天)，在新生大鼠出生時隨機(jī)抽取部分新生鼠在生后24小時內(nèi)采血，并使用氣相色譜儀進(jìn)行血漿脂肪酸成份的測定。其余幼鼠給予缺氧2h，然后隨機(jī)進(jìn)入高氧復(fù)蘇組和空氣氧復(fù)蘇組

4、。幼鼠在窒息后即刻，復(fù)蘇1天、復(fù)蘇3天和復(fù)蘇7天時分別采血，用比色法檢測：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的含量；用熒光定量PCR方法檢測PPAR-γ的表達(dá)量；用免疫熒光法檢測各組幼鼠在復(fù)蘇7天時肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)纖維肌動蛋白(F-actin)的形態(tài)變化；用免疫沉淀法檢測肌動蛋白(actin)的表達(dá)量；通過病理檢查觀察各組幼鼠在復(fù)蘇3天和7天時肺纖維化的發(fā)生率及嚴(yán)重程度。 結(jié)果：第一部分

5、：孕期補(bǔ)充DHA組母鼠分娩的新生大鼠血漿中脂肪酸的成份與未補(bǔ)充組幼鼠進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充DHA組幼鼠血漿中二十碳五烯酸(EPA，C20:5)的含量(0.53±0.08％)和二十二碳六烯酸(DHA，C22:6)的含量(17.51±0.39％)顯著高于未補(bǔ)充組幼鼠(0.40±0.09％，p＜0.01和4.46±0.47％，p＜0.01)。第二部分：在高氧和空氣氧復(fù)蘇1天、3天和7天時各組幼鼠血中的SOD值比較，差異均有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(F=5

6、.932，p＜0.01；F=5.571，p＜0.01和F=11.68，p＜0.01)；普食+高氧復(fù)蘇組幼鼠其血中的SOD值在高氧1天、3天和7天時均顯著高于普食+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠(p＜0.05)；補(bǔ)充DHA+高氧復(fù)蘇組的幼鼠在高氧復(fù)蘇1天、3天和7天時的SOD值也均顯著高于補(bǔ)充DHA+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠(p＜0.05)；補(bǔ)充DHA組幼鼠在高氧復(fù)蘇7天時的SOD值顯著高于普食+高氧復(fù)蘇組幼鼠(p＜0.05)。幼鼠缺氧后在高氧和空氣氧復(fù)蘇1天

7、、3天和7天時各組幼鼠血中MDA值比較，差異也均有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.31，p＜0.01；F=13.867，p＜0.01；F=8.907，p＜0.01)；普食組幼鼠血中的MDA值在高氧復(fù)蘇1天、3天和7天時均顯著高于普食+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠(p＜0.05)；補(bǔ)充DHA+高氧復(fù)蘇組幼鼠在高氧復(fù)蘇1天和3天時的MDA值均顯著高于DHA+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠(p＜0.05)；補(bǔ)充DHA組幼鼠血中的MDA值在高氧復(fù)蘇3天和7天時均顯著低于普食

8、+高氧復(fù)蘇組幼鼠(p＜0.05)。幼鼠在窒息后即刻、高氧或空氣氧復(fù)蘇1天、3天和7天時各組GSH-Px的值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.788，p＞0.05；F=0.663，p＞0.05；F=2.47，p＞0.05；F=1.242，p＞0.05)。第三部分：各組幼鼠窒息后在高氧或空氣氧復(fù)蘇7天時PPAR-γ表達(dá)量的差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.693，p＜0.05)；補(bǔ)充DHA+高氧復(fù)蘇組幼鼠和補(bǔ)充DHA+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠的PPA

9、R-γ表達(dá)量均顯著高于普食+高氧復(fù)蘇組幼鼠的PPAR-γ表達(dá)量(p＜0.05)；補(bǔ)充DHA+高氧復(fù)蘇組幼鼠和補(bǔ)充DHA+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠的PPAR-γ表達(dá)量均顯著高于普食+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠的PPAR-γ表達(dá)量(p＜0.05)；普食組幼鼠在高氧復(fù)蘇7天時的PPAR-γ表達(dá)量顯著低于高氧復(fù)蘇1天時的PPAR-γ表達(dá)量(p＜0.05)。第四部分：觀察到高氧或空氣氧復(fù)蘇的各組幼鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)的纖維肌動蛋白(F-actin)主要有3種形態(tài)：(1

10、).普食+高氧復(fù)蘇組主要表現(xiàn)為F-actin聚集成多個塊狀(＞2個)，肌動蛋白絲分布極不均勻；(2).補(bǔ)充DHA+高氧復(fù)蘇組F-actin分布尚均勻，僅有少量聚集成塊的F-actin(≤2個)；(3).普食+空氣氧復(fù)蘇組和補(bǔ)充DHA+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠的F-actin表現(xiàn)為，在整個細(xì)胞內(nèi)可見均勻分布的紅色呈細(xì)短狀的肌動蛋白，沒有明顯的聚集成塊。通過較為靈敏的Westernblot實(shí)驗(yàn)方法測定高氧和空氣氧復(fù)蘇7天時新生大鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)肌動

11、蛋白(actin)的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)普食+高氧復(fù)蘇組的表達(dá)量顯著高于普食+空氣氧復(fù)蘇組，也高于補(bǔ)充DHA+高氧復(fù)蘇組和補(bǔ)充DHA+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠的肌動蛋白表達(dá)量，差異均有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；補(bǔ)充DHA+高氧復(fù)蘇組幼鼠的actin表達(dá)量雖然高于普食+空氣氧復(fù)蘇組及DHA+空氣氧復(fù)蘇組，但差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義。第五部分：各組幼鼠的肺病理纖維化程度的比較，窒息后高氧或空氣氧復(fù)蘇3天和7天時的肺纖維化評分在各組間的差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)

12、意義(X2=107.084，p＜0.01和X2=127.676，p＜0.01)。其中，高氧復(fù)蘇3天時，普食+高氧復(fù)蘇組幼鼠其肺病理纖維化評分的中、重度百分比最高(60.4％)；普食+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠的肺病理纖維化評分其正常的百分比最高(38.5％)；普食+高氧復(fù)蘇組幼鼠的肺病理纖維化發(fā)生率在高氧復(fù)蘇3天和7天時均顯著高于普食+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠(p＜0.01)和補(bǔ)充DHA+高氧復(fù)蘇組幼鼠(p＜0.01)；DHA+高氧復(fù)蘇組幼鼠的肺纖維化發(fā)

13、生率與DHA+空氣氧復(fù)蘇組幼鼠比較，在復(fù)蘇3天時兩組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但到復(fù)蘇7天時DHA+高氧復(fù)蘇組幼鼠的肺纖維化發(fā)生率顯著升高(p＜0.01)。 結(jié)論：(1)母鼠孕期補(bǔ)充DHA能顯著增加其出生的新生大鼠血漿中的DHA含量。(2)高氧復(fù)蘇可刺激新生大鼠體內(nèi)抗氧化酶(SOD)值的升高，補(bǔ)充DHA組幼鼠其體內(nèi)SOD值可反應(yīng)性地升高，顯著高于未補(bǔ)充DHA的新生大鼠。窒息新生大鼠在高氧復(fù)蘇時體內(nèi)過氧化產(chǎn)物產(chǎn)生增加，補(bǔ)充DHA后能顯著

14、降低新生大鼠高氧復(fù)蘇時過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生。提示在高氧情況下DHA能增加機(jī)體的抗氧化酶并能減少過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生。(3)高氧所致的肺部炎性損傷可能與PPAR-γ的下降有關(guān)，補(bǔ)充DHA可減少高氧復(fù)蘇時PPAR-γ表達(dá)量的下降，減輕肺部炎性損傷。(4)高氧可引起幼鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)纖維肌動蛋白的聚集，使肌動蛋白絲分布紊亂，DHA可抑制纖維肌動蛋白的聚集，同時可抑制肌動蛋白的新生，對肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬能力有保護(hù)作用。(5)缺氧新生大鼠在高氧復(fù)蘇時肺部