烏拉坦誘導小鼠肺癌變過程中l(wèi)ncRNA表達改變.pdf

1、背景與目的：
　　長片段非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，不具有編碼蛋白質功能，但在基因表達調控方面發(fā)揮著十分重要的作用。大量的研究表明，lncRNA數量龐大，且調控的方式多種多樣，它通過與DNA、RNA、蛋白質的相互作用，在生命活動調控網絡中扮演著十分重要的角色。目前對lncRNA的致病機制還知之甚少，但大量臨床觀察和實驗證據顯示，lncRNA可能通過轉錄前或轉錄后水平調控編碼蛋白基因的表

2、達，從而參與物種進化、胚胎發(fā)育、干細胞的維持、細胞的增殖分化以及腫瘤的發(fā)生等多種重要的調控過程。肺癌的發(fā)病率和死亡率在世界許多國家均居各種惡性腫瘤的首位，嚴重危害人們的健康和生命。目前，肺癌的診斷主要通過傳統(tǒng)的痰細胞學、影像學等診斷技術，它們在肺癌的診斷方面缺乏特異性，與其它肺部疾病，如肺炎，肺結核等難以鑒別。因此發(fā)現新的、適用于高危人群篩查，具有較高特異性和靈敏性的診斷方法是提高肺癌患者生存率的重要途徑。隨著腫瘤分子生物學研究的發(fā)展，

3、使從分子水平上診斷肺癌成為可能?，F有的研究表明，lncRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，lncRNA的異常表達存在于很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，如研究發(fā)現MALAT-1在非小細胞肺癌中呈過表達、PCGEM1在前列腺癌細胞中過量表達等。然而，目前對于lncRNA是否參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展過程及其作用機制仍然不清楚。因此，探討肺癌發(fā)生發(fā)展過程中l(wèi)ncRNA的表達譜變化，發(fā)現可能的特異性肺癌相關lncRNA分子標記物，對于肺癌的早期診斷具有

4、重要的意義?；趌ncRNA可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，本研究以烏拉坦誘導的BALB/c小鼠肺癌模型為基礎，研究肺癌發(fā)生發(fā)展過程中l(wèi)ncRNA表達改變的情況，發(fā)現可能的特異性肺癌相關lncRNA分子標記物，為lncRNA參與化學致癌機制提供了一定實驗證據。
　　方法：
　　1.建立小鼠肺癌模型以1000mg/kg的劑量在小鼠右下腹腔內注射烏拉坦（溶于200μl PBS磷酸鹽緩沖液中），每周注射一次，連續(xù)四次；對照組每

5、只小鼠在右下腹腔內注射100μl PBS磷酸鹽緩沖液，每周注射一次，連續(xù)四次。分批將烏拉坦染毒后3個月的小鼠和6個月的小鼠處死，取出肺組織及腫瘤組織。
　　2.組織的病理分析制作對照組肺組織及烏拉坦處理組的肺腫瘤的病理切片，HE染色后，顯微鏡下觀察組織病理改變情況。
　　3.表達譜芯片檢測采用Invitrogen公司的Mouse Non-coding RNA Microarray（包含10802個小鼠lncRNA分子，251

6、79個小鼠mRNA分子）分別對烏拉坦染毒后6個月的小鼠肺腫瘤組織、癌旁組織及對照組肺組織進行基因表達譜分析。
　　4.差異表達譜的分析分析表達譜中差異表達的lncRNA基因，篩選出表達倍數大于5倍的lncRNA。
　　5. qRT-PCR驗證芯片結果取肺腫瘤組織與正常肺組織各三個生物學重復樣，用qRT-PCR定量檢測lncRNA表達改變是否與芯片結果相一致。
　　6. qRT-PCR檢測lncRNA表達水平采用SYBR

7、 Green染料法分別對烏拉坦染毒后3個月及6個月的小鼠正常肺組織、肺腫瘤組織和癌旁組織進行qRT-PCR定量檢測目的基因的表達水平。
　　7.統(tǒng)計分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。各實驗組數據均以x±s表示，試驗數據均重復3次。滿足正態(tài)分布且方差齊同的兩組間 lncRNA表達差異的比較，采用兩組獨立樣本的t檢驗，不滿足正態(tài)分布時采用非參數檢驗。所有檢驗均以雙側P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：

8、　　1.動物模型結果對照組小鼠均沒有發(fā)現肺腫瘤，烏拉坦染毒后3個月的小鼠肺腫瘤的發(fā)生率為85％，每只小鼠平均腫瘤數為2.81±2.04，腫瘤的平均大小為0.68±0.20；烏拉坦染毒后6個月的小鼠肺腫瘤的發(fā)生率為100%，每只小鼠平均腫瘤數為6.00±2.07，腫瘤的平均大小為1.76±1.34。
　　2.組織病理切片結果對照組小鼠肺組織切片無明顯的增生性或腫瘤性病變，實驗組小鼠肺腫瘤具有一致的外觀形態(tài)，腫瘤組織切片可見腺癌結節(jié)，

9、均為腺癌。
　　3. lncRNA芯片表達譜結果在肺腫瘤組織中l(wèi)ncRNA均上調或下調表達倍數在5倍以上且三次生物學重復 P<0.01的lncRNA有42個，其中上調表達的lncRNA有14個，下調表達的lncRNA有28個。
　　4. qRT-PCR驗證芯片結果 qRT-PCR定量檢測 AF498294、AK017233和AK017306的表達改變情況與芯片結果相一致。
　　5. qRT-PCR檢測lncRNA表達水

10、平結果烏拉坦染毒后3個月和6個月的小鼠肺腫瘤組織中AF498294均是上調表達的，AK017233和AK017306均是下調表達；烏拉坦染毒后6個月的小鼠腫瘤組織中的AF498294表達水平比烏拉坦染毒后3個月的小鼠腫瘤組織高；烏拉坦染毒后3個月和6個月的小鼠肺癌旁組織與對照組肺組織相比較，AF498294均是上調表達的。
　　結論：
　　1.經腹腔注射烏拉坦，可誘導BALB/c小鼠肺組織發(fā)生癌變，為本研究的后續(xù)工作建立了小