蒙藥寒水石化灰小劑抗癌藥效學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　寒水石化灰小劑炮制方法特殊，是蒙藥灰化劑中的重要代表方劑，本課題將對寒水石化灰小劑進行藥效方面探究，為其臨床合理用藥提供理論依據(jù)。
　　方法：
　?。?）四氮唑鹽比色法及細胞集落實驗檢測梯度濃度寒水石化灰小劑對人胃癌細胞MGC80-3增殖的影響；Hoechst33342/PI雙染，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)；采用蛋白印跡技術(shù)(Western blotting)檢測不同濃度寒水石化灰小劑作用后，胃癌細胞凋亡

2、相關(guān)蛋白bcl-2、bax表達；實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測bcl-2、bax基因的表達；酶聯(lián)免疫吸附法檢測不同濃度藥物對腫瘤細胞血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的影響。
　?。?）建立BALB/c荷瘤小鼠模型，隨機分組給藥后，取腫瘤組織稱重計算抑瘤率；腫瘤組織常規(guī)制作病理切片觀察藥物對荷瘤小鼠瘤組織變化的影響；應(yīng)用Westernblotting方法檢測凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax的表達，分析bcl-2/bax比值變化

3、與藥物干預(yù)的關(guān)系；應(yīng)用Western blotting方法觀察寒水石化灰小劑對血管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物CD34在瘤組織中的蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）四氮唑鹽比色法及細胞集落實驗結(jié)果顯示：寒水石化灰小劑呈劑量依賴性抑制胃癌MGC80-3細胞增殖，隨著濃度增加抑制率逐漸增強，細胞集落形成逐漸減少；熒光顯微鏡觀察5-Fu陽性組、寒水石化灰小劑各劑量干預(yù)組均表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)特征，且隨藥物濃度增加，呈現(xiàn)凋亡細胞逐漸增多的趨

4、勢；Western blotting實驗結(jié)果顯示，寒水石化灰小劑下調(diào)人胃癌細胞bcl-2蛋白的表達，增加bax蛋白表達，Bcl-2/Bax比值隨藥物干預(yù)濃度和干預(yù)時間增加依序減?。籖T-PCR實驗結(jié)果表明梯度濃度寒水石化灰小劑作用24h后，Bcl-2/Bax基因表達比值隨濃度增加逐漸降低，相同濃度藥物干預(yù)隨時間延長比值減??；酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果顯示，寒水石化灰小劑能抑制胃癌細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）
　?。?）荷瘤小鼠環(huán)

5、磷酰胺陽性組和協(xié)同給藥組平均體重顯著小于模型組小鼠（P<0.05），而其他給藥組小鼠體重與模型對照組無顯著差異；協(xié)同給藥組、環(huán)磷酰胺組和中劑量組瘤體重量和體積均顯著低于模型組(P<0.05或P<0.01)；病理切片觀察發(fā)現(xiàn)模型組腫瘤組織血管豐富，壞死率約為10％-15%，高劑量、中劑量給藥組血管相對較少，纖維化明顯，壞死率明顯高于模型組；小鼠腫瘤組織的Western blotting結(jié)果顯示：與模型對照組相比給藥組Bcl-2蛋白表達降低

6、，而Bax蛋白表達增加，Bcl-2/Bax比值降低，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P<0.05)，與模型組相比，協(xié)同給藥組的腫瘤組織中血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD34蛋白表達最低，寒水石化灰小劑各給藥組CD34蛋白表達均有降低，但沒有明顯的量效關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　寒水石化灰小劑能顯著抑制人胃癌細胞株的增殖，誘導(dǎo)癌細胞凋亡，抑制血管生成，抑制小鼠腋下實體瘤生長，其抗癌活性機制可能是下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達，上調(diào)凋亡促進基因Bax表達，