鉤端螺旋體外膜脂蛋白LipL32的克隆、表達(dá)及其在鉤端螺旋體抗體檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、鉤端螺旋體病(簡(jiǎn)稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)引起的一種人獸共患的自然疫源性疾病。鉤體血清型別眾多，臨床表現(xiàn)多種多樣。目前鉤體病血清學(xué)的主要檢測(cè)方法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)即顯微鏡凝集試驗(yàn)(MAT)，需要培養(yǎng)各種血清型的鉤體活菌，操作繁瑣，安全性差且需要暗視野顯微鏡，無法在基層開展該項(xiàng)目的檢測(cè)工作。鉤體外膜脂蛋白LipL32是各種致病性鉤體中高度保守的抗原成份，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。因此該抗原有可能應(yīng)用于抗體檢測(cè)。 本課題用PC

2、R法擴(kuò)增致病性鉤端螺旋體黃疸出血群(56601株)LipL32蛋白的全長(zhǎng)基因片段，與表達(dá)載體pET-30a(+)連接并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)重組蛋白，Western blot鑒定免疫活性后用電洗脫法進(jìn)行純化。純化后的LipL32重組蛋白用間接ELISA和夾心ELISA法對(duì)不同的人和動(dòng)物血清進(jìn)行檢測(cè)，以MAT為參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。 主要結(jié)果如下： 1.純化的重組蛋白用間接ELIsA和夾心ELISA法對(duì)致病性鉤體1

3、5株標(biāo)準(zhǔn)菌株的兔免疫血清全部檢出，對(duì)7株腐生性鉤體菌株的兔免疫血清全部未檢出，與MAT檢測(cè)結(jié)果相符。表明該重組蛋白能區(qū)別腐生性和致病性鉤體感染。進(jìn)一步確證黃疸出血群(5660l株)外膜脂蛋白LipL32基因在致病性鉤體中高度保守。 2.重組蛋白檢測(cè)確診鉤體病人的9例急性期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本，急性期9份血清，MAT有2份出現(xiàn)陽性，間接ELISA和夾心ELISA法分別可檢出3份和2份陽性，進(jìn)口ELISA檢測(cè)試劑盒則是2份陽性，4份

4、可疑。對(duì)于恢復(fù)期9份血清，MAT檢出9份陽性，間接ELISA和夾心ELISA法均檢出8份陽性，進(jìn)口ELISA則是1份陽性，7份可疑。提示該重組蛋白包被的間接ELISA和夾心ELISA在鉤體病檢測(cè)方面與MAT相似，恢復(fù)期優(yōu)于進(jìn)口試劑盒。 3.重組蛋白檢測(cè)不同血清標(biāo)本，45份MAT陽性標(biāo)本，間接ELIsA法敏感性為71.11％(32/45)，夾心ELISA敏感性為80.00％(36/45)，而進(jìn)口ELISA試劑盒檢測(cè)則是陽性13份，

5、占28.89％(13/45)，25份可疑占55.56％(25/45)。在特異性檢測(cè)方面，檢測(cè)MAT陰性血清59份(其中健康體檢血清43份，非鉤體發(fā)熱病人16份，包括恙蟲病陽性和出血熱陽性各8份)間接ELISA和夾心ELISA法特異度均為96.61％(57/59)，進(jìn)口ELISA檢測(cè)健康體檢血清14份，均為陰性，檢測(cè)非鉤體發(fā)熱病人16份，則出現(xiàn)1份陽性，12份可疑。對(duì)梅毒螺旋體質(zhì)控陽性血清10份，四種方法均為陰性。證明該重組抗原在敏感性方

6、面略高于進(jìn)口試劑盒，特異性與MAT相同，大大好于進(jìn)口試劑盒，在鉤體流行病學(xué)大樣本人群調(diào)查中可用于初篩。 4.重組蛋白應(yīng)用于夾心ELISA法檢測(cè)鼠血清標(biāo)本，以MAT為標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)274份標(biāo)本，夾心ELISA的敏感性為86.75％(131/151)，特異性為99.19％(122/123)，符合率為92.34％(253/274)。結(jié)果表明夾心ELISA對(duì)鼠血清鉤體抗體的檢測(cè)顯示較好的敏感性和特異性。夾心ELISA操作簡(jiǎn)單，特別適用于大樣