鉤端螺旋體病疫苗相關(guān)外膜蛋白的研究.pdf

1、本研究分為以下二部分： 第一部分：鉤端螺旋體病疫苗相關(guān)外膜蛋白的研究 鉤端螺旋體屬于螺旋體目螺旋體科鉤端螺旋體屬。其中致病性鉤體引起鉤體病，此病人畜共患并呈全球分布。人通過直接或間接接觸感染動物的尿液而感染。鉤體病的臨床特點(diǎn)為高熱、頭痛、寒戰(zhàn)、乏力、淋巴結(jié)腫大和明顯的肌肉疼痛。重者可并發(fā)肺出血、黃疸、腦膜腦炎和腎功能衰竭等。為更好的防治鉤體病，疫苗的研究一直是鉤端螺旋體研究的重點(diǎn)。楊宏亮等首先以完成測序的問號鉤端螺旋體黃

2、疸出血群賴型賴株(56601株)和哥本哈根型FiocruzL1-130株等的全基因組序列為基礎(chǔ)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、比較基因組學(xué)方法，篩選出了226個可能的疫苗候選基因。 本實(shí)驗(yàn)從中選擇了9個預(yù)測表達(dá)于外膜的疫苗候選基因(LA1100、LA0301、LA3469、LA3744、LA1507、LA2208、LA2757、LA3506、LA0957)進(jìn)行了克隆表達(dá)純化，得到了九個相應(yīng)的重組蛋白并制備了相應(yīng)的抗體。運(yùn)用此

3、純化的蛋白，通過westernblot檢測了這9個蛋白在鉤端螺旋體全菌疫苗免疫后金黃地鼠的血清中抗體的產(chǎn)生情況，結(jié)果表明除LA3506外，其余8個重組蛋白的抗體均能在血清中檢出。 本課題對其中LA3744和LA1100兩個基因所編碼蛋白進(jìn)行了深入研究。PCR和Westernblot檢測了它們在15個中國流行的血清群代表株中的保守性，發(fā)現(xiàn)這兩個基因及其編碼的蛋白在中國流行的15個血清群代表株的14株中均有相當(dāng)高的保守性，且在非致病

4、性雙曲鉤端螺旋體未檢出。熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)、表面免疫熒光(surfaceimmun of luorescence)及TritonX-114分離鉤體膜組分等3種方法檢測編碼蛋白的亞細(xì)胞定位，證實(shí)這兩種蛋白是鉤體表面暴露蛋白，但LA3744所編碼pL40蛋白只存在于外膜，而LA1100編碼蛋白PL61在外膜和周漿間隙均有分布。ELISA分別檢測感染鉤端螺旋體的小鼠、豚鼠和金黃地鼠不同時間段血清中這兩個重組蛋白抗體滴度，三種血清中

5、都能檢出pL40抗體，而且在從第7天到第28天不同感染時間的血清其抗體滴度逐漸增高，說明當(dāng)致病性鉤體56601株感染哺乳動物時，有pL40蛋白表達(dá)。據(jù)此推測pL40可能在鉤體致病中發(fā)揮作用。由于其在致病株中的保守性以及其為螺旋體中的特有蛋白，因此可以作為一個有價值的診斷抗原和疫苗候選蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的研究。與PL40蛋白不同，在這三種血清中均未檢出PL61抗體。為了檢測PL61蛋白在鉤端螺旋體感染時是否表達(dá)，分離體內(nèi)感染的鉤體進(jìn)行west

6、ernblot，也未檢出該蛋白表達(dá)，此蛋白可能為鉤體體外特異表達(dá)的蛋白，對此蛋白進(jìn)行進(jìn)一步研究有助于在分子水平闡明鉤端螺旋體適應(yīng)體內(nèi)外復(fù)雜環(huán)境的調(diào)控機(jī)制。 第二部分：鉤端螺旋體不同傳代次數(shù)的致病株與減毒株表達(dá)譜差異的研究 鉤端螺旋體由于缺乏有效的遺傳工具，對其研究，尤其對其致病機(jī)制的研究還較困難，因此對其致病機(jī)理的研究還不是很深入。本實(shí)驗(yàn)室于2004年根據(jù)2002年完成的鉤端螺旋體的全基因組測序工作注釋的ORFs設(shè)計(jì)了鉤

7、端螺旋體的cDNA芯片，并根據(jù)此芯片進(jìn)行了毒力株不同傳代次數(shù)之間表達(dá)譜差異的研究。本試驗(yàn)擬通過該芯片，分別研究了不同傳代的毒力株和減毒株間表達(dá)譜的差異。 鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株毒力株56601株(中賴)與減毒株鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株IPAV(法賴)雖然遺傳背景上相似，但毒力卻有很大的差別。本試驗(yàn)以37℃為試驗(yàn)的培養(yǎng)條件，分別以原代培養(yǎng)的鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株毒力株56601和體外傳代20次的56601株為測試株

8、，以鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株IPAV株為對照株，利用鉤端螺旋體的cDNA芯片測試了不同傳代次數(shù)毒力株與減毒株芯片表達(dá)譜的差異。結(jié)果表明，無論是原代還是第二十代毒力株和減毒株的表達(dá)譜均具有明顯的差別。原代56601株上調(diào)表達(dá)的基因有103個，下調(diào)表達(dá)的有85個；第二十代56601株上調(diào)表達(dá)的基因有217個，下調(diào)表達(dá)的有193個。這些差異表達(dá)的基因在功能上可以分12類，分屬于致病相關(guān)基因、無機(jī)離子運(yùn)輸基因、信號傳導(dǎo)機(jī)制相關(guān)基因、細(xì)胞壁/

9、膜合成相關(guān)基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因、蛋白質(zhì)翻譯后修飾及折疊基因、防御機(jī)制相關(guān)基因、新陳代謝相關(guān)基因、細(xì)胞動力相關(guān)基因、胞內(nèi)分選及分泌相關(guān)基因、信息存儲及加工基因及其它功能基因。這些差異表達(dá)的基因可能與鉤端螺旋體致病有關(guān)。 從芯片結(jié)果還可看出，體外傳代二十次的鉤端螺旋體體內(nèi)發(fā)生了較為明顯的變化。變化較為明顯基因包括細(xì)胞動力相關(guān)基因、細(xì)胞壁及膜生成相關(guān)基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因及新陳代謝相關(guān)基因等，這些可能與以前所報(bào)道的細(xì)胞膜分子的變化及