基于mPEG-PLGA納米載體蛋白質(zhì)內(nèi)耳遞送研究.pdf

1、多種原因如強噪聲暴露或者耳毒性藥物應(yīng)用等都能夠引起耳蝸內(nèi)組織結(jié)構(gòu)或者細胞的受損。一般情況下,這種損害過程都開始于耳蝸毛細胞(包括外毛細胞和內(nèi)毛細胞),隨后引起 Corti’s器結(jié)構(gòu)的破壞,最終導(dǎo)致聽覺損傷。耳聾相關(guān)研究認為,聽覺損傷最終得以治療,最根本的方法還是通過外源生物干預(yù)治療使耳蝸毛細胞再生,或者在耳蝸毛細胞損傷的特定病理時期進行相關(guān)干預(yù),最終使之得到修復(fù)。
　　在各種研究開發(fā)的耳聾治療方案中,生物治療是最具有應(yīng)用潛力的。同

2、時,內(nèi)耳結(jié)構(gòu)內(nèi)部流動的液體以及相對狹小獨立的空間等特點又使得耳蝸可以作為理想的生物治療體系加以研究應(yīng)用?？茖W(xué)家們經(jīng)過對不同類型耳聾發(fā)病機制和聽覺神經(jīng)細胞發(fā)育的研究和探索,先后發(fā)現(xiàn)了一系列針對聽功能起保護或修復(fù)作用的核酸、多肽和小分子化合物等,這些生物分子可以通過對內(nèi)耳感覺細胞的修復(fù)或再生,實現(xiàn)聽功能不同程度的保護或恢復(fù)。
　　選擇合適的遞送載體將目的高效、安全地導(dǎo)入內(nèi)耳組織和細胞中,是耳聾生物治療的關(guān)鍵。常用的載體分為兩大類:病毒

3、載體及非病毒載體。上世紀九十年代,研究人員首次使用病毒載體將外源基因?qū)雰?nèi)耳,開創(chuàng)了內(nèi)耳細胞保護或再生研究中載體技術(shù)開發(fā)應(yīng)用的先河。然而,病毒性載體的缺陷,以及以往報道的致死性個案病例,又讓人們開始重新審視應(yīng)用病毒性載體的安全問題。近年來,對于載體的選擇及應(yīng)用研究,逐漸轉(zhuǎn)向了非病毒性載體,其中,納米載體應(yīng)用又成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展熱點。研究證實,納米載體能夠在生物治療過程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的表達特性,具備較高的安全性及細胞特異性等優(yōu)點,為傳統(tǒng)

4、的耳病防治和干預(yù)研究提供了全新的策略。
　　聚乳酸-羥基乙酸(poly(D,L-lactide-co-gly-colide),PLGA)是最具代表性的一類納米類載體系統(tǒng),為丙交酯和乙交酯的共聚物,具有良好的生物相容性及生物可降解性。經(jīng)PEG修飾的PLGA納米載體復(fù)合物結(jié)構(gòu)可控,在生理 pH值條件下,通過PLGA疏水性核心包載多種多肽、蛋白質(zhì)類藥物,并且依靠該復(fù)合物表面的PEG與帶有負電荷的細胞膜結(jié)合并相互作用,保證了多肽、蛋白質(zhì)類

5、藥物在無明顯降解的情況下,通過包吞作用進入細胞內(nèi),發(fā)揮治療疾病的作用。
　　本實驗第一部分通過對PLGA的表面修飾,成功獲得具有緩釋功能的PLGA-PEG納米顆粒遞送載體,并且通過雙乳法包載BSA蛋白,成功制備mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs,且包載率達到51.2％。第二部分應(yīng)用已經(jīng)合成mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs體外轉(zhuǎn)導(dǎo)Hela細胞系,用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)FITC熒光情況,評估m(xù)PEG-P

6、LGA-BSA-FITC-NPs體外進入細胞的效率,同時用MTT法檢測mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs納米遞送系統(tǒng)對于Hela細胞的毒性并計算細胞存活率。同時,我們首次通過手術(shù)手段,應(yīng)用mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs經(jīng)完整圓窗膜滲透途徑導(dǎo)入活體豚鼠內(nèi)耳中,用共聚焦顯微鏡觀察并評估m(xù)PEG-PLGA-BSA-FITC-NPs在內(nèi)耳的有效率,驗證并突出強調(diào)mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs作為一種新型納米

7、載體在內(nèi)耳毛細胞再生中的應(yīng)用潛力。在實驗的第三部分,我們開創(chuàng)性的應(yīng)用脈沖式火花噪聲儀對正常小型豬進行噪聲暴露,通過對強噪聲暴露后的小型豬模型進行聽功能評估及耳蝸病理形態(tài)學(xué)研究,首次成功建立了基于大型哺乳動物的噪聲性聾小型豬動物模型,為此后內(nèi)耳導(dǎo)入研究奠定基礎(chǔ)。最后,我們嘗試應(yīng)用mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs進行噪聲性聾小型豬動物模型內(nèi)耳導(dǎo)入研究,以期為mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs納米載體的內(nèi)耳應(yīng)用提供重要的

8、臨床前研究數(shù)據(jù)。
　　本研究創(chuàng)新點:
　　1.用PEG修飾PLGA納米顆粒,并成功通過雙乳法包載BSA蛋白,最終獲的大小約為232±2.6nm、具有良好分散性和緩釋特性的納米顆粒蛋白遞送體系;
　　2.成功將mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs體外導(dǎo)入細胞系,并獲得較高安全性和有效性。同時,首次實現(xiàn)mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs在體豚鼠內(nèi)耳遞送,并呈現(xiàn)明顯的時間依賴性。
　　3.首次成功建立