基于mPEG-PLGA納米載體蛋白質(zhì)內(nèi)耳遞送研究.pdf

1、多種原因如強(qiáng)噪聲暴露或者耳毒性藥物應(yīng)用等都能夠引起耳蝸內(nèi)組織結(jié)構(gòu)或者細(xì)胞的受損。一般情況下,這種損害過(guò)程都開(kāi)始于耳蝸毛細(xì)胞(包括外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞),隨后引起 Corti’s器結(jié)構(gòu)的破壞,最終導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)損傷。耳聾相關(guān)研究認(rèn)為,聽(tīng)覺(jué)損傷最終得以治療,最根本的方法還是通過(guò)外源生物干預(yù)治療使耳蝸毛細(xì)胞再生,或者在耳蝸毛細(xì)胞損傷的特定病理時(shí)期進(jìn)行相關(guān)干預(yù),最終使之得到修復(fù)。
　　在各種研究開(kāi)發(fā)的耳聾治療方案中,生物治療是最具有應(yīng)用潛力的。同

2、時(shí),內(nèi)耳結(jié)構(gòu)內(nèi)部流動(dòng)的液體以及相對(duì)狹小獨(dú)立的空間等特點(diǎn)又使得耳蝸可以作為理想的生物治療體系加以研究應(yīng)用?？茖W(xué)家們經(jīng)過(guò)對(duì)不同類(lèi)型耳聾發(fā)病機(jī)制和聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的研究和探索,先后發(fā)現(xiàn)了一系列針對(duì)聽(tīng)功能起保護(hù)或修復(fù)作用的核酸、多肽和小分子化合物等,這些生物分子可以通過(guò)對(duì)內(nèi)耳感覺(jué)細(xì)胞的修復(fù)或再生,實(shí)現(xiàn)聽(tīng)功能不同程度的保護(hù)或恢復(fù)。
　　選擇合適的遞送載體將目的高效、安全地導(dǎo)入內(nèi)耳組織和細(xì)胞中,是耳聾生物治療的關(guān)鍵。常用的載體分為兩大類(lèi):病毒

3、載體及非病毒載體。上世紀(jì)九十年代,研究人員首次使用病毒載體將外源基因?qū)雰?nèi)耳,開(kāi)創(chuàng)了內(nèi)耳細(xì)胞保護(hù)或再生研究中載體技術(shù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用的先河。然而,病毒性載體的缺陷,以及以往報(bào)道的致死性個(gè)案病例,又讓人們開(kāi)始重新審視應(yīng)用病毒性載體的安全問(wèn)題。近年來(lái),對(duì)于載體的選擇及應(yīng)用研究,逐漸轉(zhuǎn)向了非病毒性載體,其中,納米載體應(yīng)用又成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展熱點(diǎn)。研究證實(shí),納米載體能夠在生物治療過(guò)程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的表達(dá)特性,具備較高的安全性及細(xì)胞特異性等優(yōu)點(diǎn),為傳統(tǒng)

4、的耳病防治和干預(yù)研究提供了全新的策略。
　　聚乳酸-羥基乙酸(poly(D,L-lactide-co-gly-colide),PLGA)是最具代表性的一類(lèi)納米類(lèi)載體系統(tǒng),為丙交酯和乙交酯的共聚物,具有良好的生物相容性及生物可降解性。經(jīng)PEG修飾的PLGA納米載體復(fù)合物結(jié)構(gòu)可控,在生理 pH值條件下,通過(guò)PLGA疏水性核心包載多種多肽、蛋白質(zhì)類(lèi)藥物,并且依靠該復(fù)合物表面的PEG與帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合并相互作用,保證了多肽、蛋白質(zhì)類(lèi)

5、藥物在無(wú)明顯降解的情況下,通過(guò)包吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),發(fā)揮治療疾病的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)第一部分通過(guò)對(duì)PLGA的表面修飾,成功獲得具有緩釋功能的PLGA-PEG納米顆粒遞送載體,并且通過(guò)雙乳法包載BSA蛋白,成功制備mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs,且包載率達(dá)到51.2％。第二部分應(yīng)用已經(jīng)合成mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs體外轉(zhuǎn)導(dǎo)Hela細(xì)胞系,用激光共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)FITC熒光情況,評(píng)估m(xù)PEG-P

6、LGA-BSA-FITC-NPs體外進(jìn)入細(xì)胞的效率,同時(shí)用MTT法檢測(cè)mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs納米遞送系統(tǒng)對(duì)于Hela細(xì)胞的毒性并計(jì)算細(xì)胞存活率。同時(shí),我們首次通過(guò)手術(shù)手段,應(yīng)用mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs經(jīng)完整圓窗膜滲透途徑導(dǎo)入活體豚鼠內(nèi)耳中,用共聚焦顯微鏡觀(guān)察并評(píng)估m(xù)PEG-PLGA-BSA-FITC-NPs在內(nèi)耳的有效率,驗(yàn)證并突出強(qiáng)調(diào)mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs作為一種新型納米

7、載體在內(nèi)耳毛細(xì)胞再生中的應(yīng)用潛力。在實(shí)驗(yàn)的第三部分,我們開(kāi)創(chuàng)性的應(yīng)用脈沖式火花噪聲儀對(duì)正常小型豬進(jìn)行噪聲暴露,通過(guò)對(duì)強(qiáng)噪聲暴露后的小型豬模型進(jìn)行聽(tīng)功能評(píng)估及耳蝸病理形態(tài)學(xué)研究,首次成功建立了基于大型哺乳動(dòng)物的噪聲性聾小型豬動(dòng)物模型,為此后內(nèi)耳導(dǎo)入研究奠定基礎(chǔ)。最后,我們嘗試應(yīng)用mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs進(jìn)行噪聲性聾小型豬動(dòng)物模型內(nèi)耳導(dǎo)入研究,以期為mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs納米載體的內(nèi)耳應(yīng)用提供重要的

8、臨床前研究數(shù)據(jù)。
　　本研究創(chuàng)新點(diǎn):
　　1.用PEG修飾PLGA納米顆粒,并成功通過(guò)雙乳法包載BSA蛋白,最終獲的大小約為232±2.6nm、具有良好分散性和緩釋特性的納米顆粒蛋白遞送體系;
　　2.成功將mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs體外導(dǎo)入細(xì)胞系,并獲得較高安全性和有效性。同時(shí),首次實(shí)現(xiàn)mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs在體豚鼠內(nèi)耳遞送,并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴(lài)性。
　　3.首次成功建立