VEGF，VEGFR-3，Ang-2，ES與喉鱗癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：頭頸腫瘤也同其它大多數(shù)實(shí)體腫瘤一樣，瘤體內(nèi)的部分細(xì)胞處于缺氧環(huán)境之中。腫瘤持續(xù)性生長和轉(zhuǎn)移需要有新生血管的形成，以新生血管為靶點(diǎn)對腫瘤進(jìn)行生物學(xué)治療已成為近幾年新的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要是研究喉鱗癌大體臨床標(biāo)本及簡單模擬實(shí)體瘤內(nèi)部常氧和低氧條件（Hypoxia Inducible Factor1 alpha，HIF-1α）下與血管生成相關(guān)的四個(gè)指標(biāo)（vascular endothelial growth factor，VEGF；va

2、scular endothelial growth factor receptor3，VEGFR-3；angiopoietin2，Ang-2； endostatin，ES）的表達(dá)，探討各個(gè)蛋白在喉鱗癌轉(zhuǎn)移過程中的確切作用。為頭頸腫瘤的治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.將所有大體臨床標(biāo)本經(jīng)4％中性甲醛液固定，石蠟包埋，5μ m連續(xù)切片，利用免疫組織化學(xué)PV（Polymer Conjugated）法即用型二步法（非

3、生物素）檢測法，檢測HIF-1α、VEGF、 VEGFR-3、Ang-2和ES的表達(dá)。
　　 2.人喉鱗癌（Hep-2）細(xì)胞培養(yǎng)于含10％新生小牛血清、青霉素（100U/ml）、鏈霉素（100μg/ml）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，常規(guī)傳代培養(yǎng)，置于37℃，5％CO2，20％O2（常氧）或37℃，5％CO2，2％O2，94％N2（低氧）的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，將細(xì)胞分為2組：A組（常氧24h組）、B組（低氧24h組

4、）。收集各組細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測HIF-1α、VEGF、VEGFR-3、Ang-2、ES蛋白表達(dá)；細(xì)胞爬片免疫組化檢測各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF、VEGFR-3、Ang-2、ES蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF、VEGFR-3、Ang-2、ESmRNA。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組織化學(xué)結(jié)果：喉鱗癌大體標(biāo)本中HIF-1α陽性顆粒呈棕黃色，主要定位于癌灶腫瘤細(xì)胞胞漿和或胞核中，與癌旁正常組織

5、比較有顯著性差異（t=14.3932，P<0.01），病理分化程度比較及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異有顯著性（p<0.01）。VEGF、VEGFR-3陽性顆粒主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿和或胞核中，表達(dá)顯著高于癌旁正常組織（VEGF t=4.736 p<0.01；VEGFR-3 t=6.561 P<0.01），病理分化程度比較差異無顯著性（p>0.05），而有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異有顯著性（p<0.05）。Ang-2陽性顆粒呈棕黃色，主要定位于癌

6、灶邊緣的腫瘤細(xì)胞胞漿，少量血管內(nèi)皮細(xì)胞也可見呈微弱表達(dá)，顯著高于癌旁正常組織（t=3.474，P<0.01），病理分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較均無顯著差異（p>0.05）。ES陽性顆粒主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿中，顯著高于癌旁正常組織（t=7.263 p<0.01），病理分化程度比較差異有顯著性（p<0.05），有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較無顯著性差異（p>0.05）。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：HIF-1α蛋白主要位于胞漿，胞核內(nèi)亦

7、可見其表達(dá)，呈棕黃色，且低氧24h組高于常氧24h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組細(xì)胞中VEGF蛋白均未著色。VEGFR-3、Ang-2蛋白為胞質(zhì)內(nèi)棕黃色粗細(xì)不均勻顆粒，核周表達(dá)最為明顯，其中低氧24h組表達(dá)明顯高于常氧24h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ES蛋白為胞質(zhì)內(nèi)棕黃色粗細(xì)不均勻顆粒，核周表達(dá)最為明顯，其中常氧24h組表達(dá)明顯高于低氧24h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0·05）。
　　 3.流式細(xì)胞化學(xué)結(jié)

8、果：HIF-1α、VEGF、VEGFR-3和Ang-2蛋白在常氧24h組（HIF-1α1.35±0.05；VEGF1.09±0.03；VEGFR-31.22±0.03；Ang-21.20±0.12）的表達(dá)量均明顯低于低氧24h組（HIF-1α1.53±0.06；VEGF1.39±0.07；VEGFR-31.93±0.14；Ang-22.04±0.09）且P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ES蛋白在常氧24h組（1.69±0.01）的表達(dá)量明

9、顯高于低氧24h組（1.07±0.19）且P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.RT-PCR結(jié)果：HIF-1α、VEGF、VEGFR-3和Ang-2mRNA在常氧24h組（HIF-1α1.33±0.10；VEGF0.94±0.02；VEGFR-30.53±0.02；Ang-20.32±0.02）的表達(dá)量明顯低于低氧24h組（HIF-1α1.74±0.13；VEGF1.00±0.02；VEGFR-30.62±0.03；Ang-

10、20.434-0.01）且P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ES mRNA在顯示常氧24h組（0.49±0.02）的表達(dá)量明顯高于低氧24h組（0.38±0.02）且P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.Pearson積差相關(guān)性分析顯示：喉鱗癌臨床組織中HIF-1α的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.8679，P<0.01），與Ang-2的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.058，P>0.05），與ES的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.268

11、P>0.05）； VEGF與VEGFR-3的表達(dá)呈高度正相關(guān)（r=0.7365，P<0.01），與ES的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.202 P>0.05）；Ang-2的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈高度正相關(guān)（r=0.8193，P<0.01），與ES的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.38P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.低氧能明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)，且這一作用發(fā)生在mRNA水平；
　　 2.HIF-1α蛋白表達(dá)