MTA1基因表達與喉鱗癌侵襲轉移的相關性及其調(diào)控作用的研究.pdf

1、背景與目的：
　　 侵襲性與轉移性是惡性腫瘤的兩個主要特征，也是影響惡性腫瘤患者預后的關鍵因素，在腫瘤侵襲轉移的復雜過程中受到眾多基因的調(diào)控。腫瘤轉移相關基因1(MTA1)是新近發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤轉移相關的基因，該基因在腫瘤轉移過程中表達明顯上調(diào)。MTA1具有組蛋白脫乙酰基酶活性，調(diào)控組蛋白脫乙酰基，通過影響染色質(zhì)的狀態(tài)來調(diào)整復制，從而發(fā)揮其生物學作用?；|(zhì)降解、細胞間的粘附及腫瘤的血管生成在腫瘤侵襲轉移的過程中均發(fā)揮著重要作用。

2、本研究通過檢測喉鱗癌組織、喉部非典型增生組織及正常黏膜組織中MTA1、MMP-9、β-catenin及EGFR的表達，以了解這些參與腫瘤侵襲轉移的基因表達在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展的作用及其相關性。利用RNA干擾技術及質(zhì)粒轉染技術觀察MTA1對HEP-2細胞生物學特性變化的影響，進一步認識MTA1對喉癌細胞侵襲轉移的調(diào)控作用。
　　 方法：
　　 采用免疫組織化學法檢測MTA1蛋白在40例正常喉黏膜上皮、37例喉不典型增生組織及4

3、0例喉鱗癌組織中的表達水平，分析MTA1在喉鱗癌組織中的作用與臨床分期、分型、病理學分級及頸淋巴結轉移的關系；采用免疫組織化學法檢測MMP-9、EGFR及β-catenin蛋白在40例喉鱗癌組織與喉正常黏膜組織中的表達，分析MMP-9、EGFR及β-catenin蛋白在喉鱗癌組織中的作用，并分析MTA1與MMP-9、EGFR及β-catenin表達的相關性。
　　 在喉癌細胞株HEP-2細胞中，采用RNA干擾技術轉染針對MTA1

4、的siRNA（MTAl-siRNA），RT-PCR法及western-blot法分別從轉錄水平與翻譯水平鑒定其基因沉默效果，并采用MTT法繪制細胞生長曲線、細胞侵襲及遷移實驗、平板克隆形成實驗、細胞黏附實驗及細胞劃痕愈合實驗等觀察細胞生物學特性的改變；穩(wěn)定轉染MTA1的表達質(zhì)粒及干擾質(zhì)粒，挑選陽性克隆，進行MTT法繪制細胞生長曲線、細胞侵襲遷移實驗、細胞黏附實驗、平板克隆形成實驗及劃痕愈合實驗，檢測MTA1基因表達水平的變化，對腫瘤細胞

5、生物學特性的影響。
　　 結果：
　　 MTA1蛋白表達于細胞核中。在喉正常黏膜組織中，MTA1蛋白呈低水平表達，陽性表達率為5.0％，而在喉鱗癌組織中，MTA1蛋白陽性表達細胞數(shù)量及染色強度均明顯增高，陽性率達到67.5％，在不典型增生組織中，MTA1表達率為37.8％，介于正常組織與喉鱗癌組織之間。MTA1核表達水平在不典型增生組織與癌組織中的表達水平均高于喉正常鱗狀上皮組織(p＜0.01)：癌組織中MTA1表達水平

6、高于不典型增生組織，且統(tǒng)計學意義顯著(p＜0.01)；MTA1蛋白在從喉正常黏膜組織、不典型增生組織到喉鱗癌組織中的表達呈進行性增加。分析MTA1在喉鱗癌組織中的表達與臨床病理學參數(shù)的關系中顯示，在40例喉鱗癌組織標本中，MTA1蛋白在低、中及高分化組織中陽性表達率分別為90.0％、72.2％及41.7％，表現(xiàn)為隨著分化程度的增高，其陽性表達率降低，有統(tǒng)計學差異(x2=6.141，p＜0.05)；在喉鱗癌原發(fā)灶中MTA1蛋白在伴有頸淋巴

7、結轉移的組織中陽性表達率為78.6％，而在不伴有頸淋巴結轉移組織中的表達率為41.7％，統(tǒng)計學分析結果顯示，MTA1蛋白的表達水平與喉鱗癌患者的頸淋巴結轉移相關，MTA1蛋白的高表達能導致頸淋巴結轉移的發(fā)生（X2=5.215，p＜0.05）；在與喉鱗癌臨床分期及分型的關系中，可見MTA1在Ⅰ、Ⅱ期的表達率較Ⅲ、Ⅳ期低，分別為53.8％、92.9％，但二者之間沒有差異(x2=0.623，p＞0.05)；MTA1與喉鱗癌臨床分型也無關(x2

8、=1.138，p＞0.05)。MMP-9、EGFR及β-catenin在喉鱗癌組織中的表達率分別為82.5％、87.5％及87.5％，而在喉正常組織中的陽性表達率分別為35.0％、37.5％及35.0％，有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)；經(jīng)過相關分析顯示，在喉鱗癌中，MTA1與MMP-9、EGFR及β-catenin的表達呈正相關(p＜0.05)。
　　 在HEP-2細胞株，轉染靶向MTA1-siRNA后，MTA1基因蛋白及mRNA

9、的表達水平明顯下降，與空白對照組及無義對照MTA1-NiRNA組相比，MTA1基因的表達被顯著抑制(p＜0.05)。在檢測隨后的細胞生物學表型中發(fā)現(xiàn)，轉染MTA1-sillNA后，細胞的生長速度減慢、體外侵襲遷移能力下降、細胞的體外黏附及克隆形成能力均下降；穩(wěn)定轉染MTA1表達質(zhì)粒及干擾質(zhì)粒后，MTT法檢測細胞的生長速度，發(fā)現(xiàn)細胞的生長速度在表達質(zhì)粒組最快，而在干擾質(zhì)粒組最慢，有統(tǒng)計學差異；在細胞體外侵襲實驗中，表達質(zhì)粒組、對照組及干擾

10、質(zhì)粒組穿膜細胞數(shù)量分別為423.6±14.15,301.2±25.4和115.4±15.52；在遷移實驗中的穿膜細胞數(shù)分別為549.2±21.51,352±25.03和120.8±17.28。在細胞遷移及侵襲實驗中，穿膜細胞數(shù)量最多的是表達質(zhì)粒轉染組，明顯高于對照組及干擾質(zhì)粒組，干擾質(zhì)粒組中細胞的穿膜能力最弱，細胞數(shù)量最少；平板克隆形成實驗中，表達質(zhì)粒組、對照組及干擾質(zhì)粒組中克隆形成數(shù)量分別為168.67±9.5、132.57±5.5和

11、57.33±4.51，可見MTA1的高表達會促進腫瘤細胞的克隆形成能力，而降低其表達，則會導致克隆形成能力的下降；在細胞劃痕愈合實驗及細胞黏附實驗中，MTA1表達質(zhì)粒轉染組細胞的劃痕愈合時間縮短、黏附能力增強，干擾質(zhì)粒組細胞劃痕愈合時間最長、黏附能力下降。
　　 結論：
　　 喉鱗癌組織中，MTA1的高表達在喉鱗癌的惡性進展、侵襲轉移及頸淋巴結的轉移中起著重要的作用，或許可以作為判斷喉鱗癌惡性程度的一個分子生物學標志：M

12、MP-9、EGFR及β-catenin蛋白在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，MTA1的過度表達與MMP-9、EGFR及β-catenin成正相關，MTA1過度表達導致腫瘤的浸潤轉移是與MMP-9、EGFR及β-catenin的異常表達共同作用的結果。在人喉癌細胞株HEP-2中，改變MTA1基因的表達水平，導致喉癌癌細胞侵襲轉移能力及其它惡性行為的變化。上調(diào)MTA1基因的表達，會增強腫瘤細胞的惡性行為，導致腫瘤的侵襲轉移；而抑制其表達，