東北三省豬附紅細(xì)胞體病分子流行病學(xué)調(diào)查及LAMP檢測(cè)方法的建立.pdf

1、附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體寄生于多種動(dòng)物和人的紅細(xì)胞表面及血漿、骨髓內(nèi)，以溶血性貧血、黃疸、發(fā)熱為主要臨床癥狀的人獸共患病。為了解東北三省豬附紅細(xì)胞體病的流行狀況及基因變異情況，本試驗(yàn)應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)東北三省的600份豬血液樣本進(jìn)行了檢測(cè)，并選取相對(duì)保守的16S rRNA核苷酸序列作為分析對(duì)象，對(duì)吉林株、遼寧株和黑龍江株豬附紅細(xì)胞體16S rRNA核苷酸序列進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)其核苷酸序列。結(jié)果表明，黑龍江省豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性率為93.5％

2、r>　?。?87/200），遼寧省豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性率為89.5%（179/200），吉林省豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性率為91.5%（183/200）。同源性分析顯示，黑龍江株、遼寧株與廣東株豬附紅細(xì)胞體基因同源性最高，均達(dá)到100%；吉林株與美國(guó)株豬附紅細(xì)胞體的基因同源性最高，為97%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，黑龍江株與遼寧株豬附紅細(xì)胞體親緣關(guān)系最近，而與吉林株豬附紅細(xì)胞體較遠(yuǎn)。研究表明，黑龍江省、遼寧省、吉林省豬附紅細(xì)胞體感染情況嚴(yán)重，吉林株、遼寧株

3、和黑龍江株豬附紅細(xì)胞體16S rRNA核苷酸序列存在差異。
　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型檢測(cè)技術(shù)，LAMP技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，成為可以替代PCR方法的新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，在核酸的研究、疾病的診斷和預(yù)防、動(dòng)物胚胎的性別鑒定和轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。鑒于國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體的報(bào)道，本研究針對(duì)豬附紅

4、細(xì)胞體的16S rRNA基因的保守區(qū)用LAMP在線設(shè)計(jì)引物軟件設(shè)計(jì)引物,對(duì)內(nèi)引物濃度、外引物濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了LAMP診斷方法，并對(duì)建立的豬附紅細(xì)胞體LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行了敏感性、特異性及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，利用LAMP技術(shù)成功檢測(cè)到豬附紅細(xì)胞體基因區(qū)，該方法的靈敏度可達(dá)到能檢測(cè)23.7 fg/μl，比PCR方法高10倍；未擴(kuò)增出新孢子蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、瑟氏泰勒蟲(chóng)的特異性條帶，具有較好的特異性；