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1、附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)寄生于宿主的紅細(xì)胞表面或游離于血漿、組織液及腦脊液中??筛腥旧窖?、牛、豬、馬、綿羊、鼠、犬、藍(lán)狐、雞等多種動物及人類。對世界多數(shù)國家的畜禽業(yè)養(yǎng)殖造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究根據(jù)Genbank上公布的牛附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列進(jìn)行牛附紅細(xì)胞體16S rRNA基因擴(kuò)增的特異性引物設(shè)計。直接對感染了牛附紅細(xì)胞體的牛全血DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,成功擴(kuò)增出黃牛、奶牛和水牛的16S rRNA基因序列,
2、建立了關(guān)于牛附紅細(xì)胞體病更為簡便的試驗室診斷方法。通過對擴(kuò)增出的黃牛、奶牛和水牛感染的附紅細(xì)胞體部分16S rRNA基因的序列測定與分析,發(fā)現(xiàn)在不同品種牛感染的附紅細(xì)胞體均屬于溫氏附紅細(xì)胞體,但存在一定的遺傳差異,其中黃牛與水牛感染的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因相似率為98.6%;黃牛與奶牛感染的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因相似率為98.3%;而奶牛與水牛感染的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因同源性最高,其相似率為99.8%。表明建立
3、的PCR特異性檢測方法可以用于鑒別牛血液是否感染了附紅細(xì)胞體。 根據(jù)重慶地區(qū)不同的地理條件和養(yǎng)殖模式,在重慶地區(qū)選擇14個區(qū)縣進(jìn)行牛附紅細(xì)胞體病的分子流行病學(xué)調(diào)查,使用本試驗室建立的牛附紅細(xì)胞體特異性檢測方法與常規(guī)試驗室檢測方法相結(jié)合,調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn),重慶市的大部分區(qū)縣牛體均有牛附紅細(xì)胞體的存在,其平均感染率為11%。而在不同的地理條件下該病的感染率存在較大的差異,其中以城口、武隆、秀山等為代表的山區(qū)牛附紅細(xì)胞體的平均感染率明顯(
4、25.6%)高于以榮昌、北碚、江北為代表的丘陵地區(qū)平均感染率(2%),同時,不同的養(yǎng)殖模式條件下感染率也存在一定的差異,散養(yǎng)方式下牛的感染率在22.7%-33.3%之間,而規(guī)?;B(yǎng)殖條件下的平均感染率為6%。 關(guān)于附紅細(xì)胞體分類,主要依據(jù)對附紅細(xì)胞體的16S rRNA基因擴(kuò)增和序列比對結(jié)果分析進(jìn)行判定,但Pospischil A,Neimark H等人用16S rRNA基因分類卻得出不同的意見。表明僅使用16S rRNA基因擴(kuò)增
5、和序列比對分析對附紅細(xì)胞體進(jìn)行分類判斷具有一定的局限性。本試驗利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)對E.wenyoni, E.suos和E.vois三種附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列進(jìn)行分析。利用篩選出的4條隨機(jī)引物對5條E. wenyonii16S rRNA基因序列、2條E.suis16S rRNA和2條E. vois16s rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果顯示相同品種家畜體內(nèi)感染的附紅細(xì)胞體擴(kuò)增條帶十分一致,不同動物感染的
6、附紅細(xì)胞體擴(kuò)增條帶存在差異,其中感染牛、羊的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列親緣關(guān)系最近,其遺傳距離指數(shù)為0.405;感染牛和羊的附紅細(xì)胞體與感染豬的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn),其遺傳距離指數(shù)分別為0.714和0.673,表明RAPD技術(shù)可用于對不同種畜間附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列進(jìn)行遺傳距離分析,但不能應(yīng)用于對同種動物感染的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列進(jìn)行遺傳距離分析。在對黃牛附紅細(xì)胞體16S
7、 rRNA基因序列RAPD分析的基礎(chǔ)上,進(jìn)行SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)建立的SCAR1和SCAR3標(biāo)記既不能對E. wenyonii16S rRNA基因序列擴(kuò)增出特異性條帶,也不能在其它感染了牛附紅細(xì)胞體的血液DNA中擴(kuò)增山特異性條帶,而SCAR2既可以作為鑒別黃牛是否感染了附紅細(xì)胞體病的分子標(biāo)記,也可以從感染黃牛、水牛和奶牛的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列中鑒別出黃牛感染的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列。表明RAPD—SCAR方
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