帕金森病運(yùn)動并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制中谷氨酸受體1的實驗研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,選擇性的中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元喪失、紋狀體多巴胺含量顯著性減少為其特征性的生化和病理特征.臨床上主要表現(xiàn)為肌強(qiáng)直、震顫、運(yùn)動遲緩及姿勢步態(tài)障礙.目前對PD主要以左旋多巴等藥物治療為主,然而長期用藥會出現(xiàn)療效減退、異動癥甚至左旋多巴衰竭綜合征等棘手的臨床問題,至今還無法得到滿意的解決.多年來科學(xué)工作者圍繞著其PD及其運(yùn)動并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的

2、研究工作,取得了一些進(jìn)展.許多研究者認(rèn)為隨PD的進(jìn)展,導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生多巴胺的能力喪失,對外源性多巴藥物的緩沖能力降低,易造成對紋狀體棘狀神經(jīng)元上多巴胺受體異常的波動性刺激.多巴胺受體和谷氨酸受體共定位于紋狀體棘狀神經(jīng)元上.波動性的多巴胺受體刺激可能引起棘狀神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化,進(jìn)而影響谷氨酸受體的狀態(tài)及突觸傳遞效率.AMPA是促離子型谷氨酸受體中的一種,其特性取決于受體的亞單位組成及磷酸化狀態(tài).最近研究表明長期多巴胺波動性刺

3、激確實改變了AMPA的特性.因此,對AMPA的特性進(jìn)行研究將是本課題的基石.此外,目前迫切需要尋找和研發(fā)新型的抗PD藥物,以替代和彌補(bǔ)已有藥物的缺陷和不足.實驗發(fā)現(xiàn),5-羥色胺(5-HT)能神經(jīng)元承擔(dān)著外源性左旋多巴脫羧成多巴胺的重要作用,5-HT1A受體激動劑可通過作用于突觸前末梢減輕多巴胺水平的波動進(jìn)而改善運(yùn)動功能.但5-HT1A受體激動劑是如何防治運(yùn)動并發(fā)癥的,其神經(jīng)生化機(jī)制是什么,目前尚不清楚.本研究擬采用左旋多巴誘導(dǎo)的運(yùn)動并發(fā)

4、癥大鼠模型探討運(yùn)動并發(fā)癥的分子機(jī)制,觀察5-HTlA受體激動劑可能的治療作用. 本課題共分為三個部分: 第一部分:左旋多巴誘發(fā)帕金森病運(yùn)動并發(fā)癥大鼠模型的建立和評價通過6-羥基多巴立體定向注射至SD大鼠前腦內(nèi)側(cè)束建立帕金森病,然后左旋多巴甲酯腹腔注射治療(50mg/kg加12.5 mg/kg芐絲肼,每天2次)3周,觀察異常不自主運(yùn)動的情況及旋轉(zhuǎn)行為.經(jīng)左旋多巴治療后,帕金森病大鼠出現(xiàn)了異常不自主運(yùn)動,包括刻板動作和對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為；

5、帕金森病大鼠呈現(xiàn)劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸增加、旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時間逐漸縮短、關(guān)期頻率遞增的趨勢,與人類異動癥、癥狀波動和開關(guān)現(xiàn)象具有相似特征.上述研究表明,成功建立了帕金森病運(yùn)動并發(fā)癥大鼠模型,為進(jìn)一步研究其機(jī)制奠定了基礎(chǔ). 第二部分:帕金森病運(yùn)動并發(fā)癥與谷氨酸受體1亞細(xì)胞分布及磷酸化關(guān)系的研究采用免疫熒光染色顯示正常大鼠紋狀體谷氨酸受體1 (GluR1) 及磷酸化GluRlS831、磷酸化GluRlS845在小清蛋白陽性的神經(jīng)元專一表達(dá),未發(fā)

6、現(xiàn)GluRl與紋狀體內(nèi)強(qiáng)啡肽、腦啡肽、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶及神經(jīng)型一氧化氮合成酶神經(jīng)元共染；6-OHDA損傷使紋狀體部位細(xì)胞膜上GluRl、磷酸化的GluRlSer831和GluRlSer845數(shù)量明顯減少；長期左旋多巴作用后使損傷側(cè)紋狀體細(xì)胞膜上GluRl和磷酸化的GluRlSer83l、GluRlSer845數(shù)量明顯上調(diào),且撤藥后其表達(dá)量仍可持續(xù)至少1天；急性左旋多巴作用后G1uRl和磷酸化的GluRlSer831、GluRlSer845

7、數(shù)量可輕度升高,但撤藥后很快降低；免疫熒光染色顯示這些改變?nèi)蕴禺愋园l(fā)生在小清蛋白陽性的神經(jīng)元上；CaMKII抑制劑KN-93注射則明顯減弱了旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時間的縮短及升高的膜GluRl與磷酸化GluRlSer831的表達(dá)；上述研究表明長期左旋多巴治療導(dǎo)致谷氨酸信號被激活了,運(yùn)動并發(fā)癥及其撤藥后持續(xù)效應(yīng)可能與GluRl的亞細(xì)胞分布及磷酸化狀況的改變有關(guān)；CaMKII信號激酶可能通過介導(dǎo)GluRl的831位絲氨酸磷酸化參與了運(yùn)動并發(fā)癥的發(fā)生.

8、 第三部分:5-羥色胺1A受體激動劑8-OH-DPAT改善帕金森病運(yùn)動并發(fā)癥的實驗研究通過6-羥基多巴胺立體定向注射至大鼠前腦內(nèi)側(cè)前腦束建立帕金森病(PD)動物模型.對模型成功的PD大鼠進(jìn)行兩套實驗:第一套實驗中3組PD大鼠接受每日兩次左旋多巴(50 mg/kg加12.5 mg/kg芐絲肼)腹腔注射,持續(xù)22天.在第23天左旋多巴注射前,3組PD大鼠先分別接受8-0H-DPAT、8-0H-DPAT+5-HT<1A>受體阻斷劑WAY-

9、100635(0.1 mg/kg)及溶劑；第二套實驗中2組PD大鼠每日兩次分別接受左旋多巴-芐絲肼+8-0H-DPAT與左旋多巴/芐絲肼+溶劑,持續(xù)22天.評估旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時間及劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)；采用蛋白印跡法檢測紋狀體區(qū)谷氨酸受體亞型GluRl亞細(xì)胞分布及磷酸化的GluRlSer831、GluRlSer845表達(dá)情況.結(jié)果顯示8-0H-DPAT 逆轉(zhuǎn)了左旋多巴所誘導(dǎo)的PD大鼠旋轉(zhuǎn)時間的縮短,減輕了劑峰旋轉(zhuǎn)次數(shù),并使關(guān)期發(fā)生頻率減少；5-HT<

10、,lA>受體阻斷劑WAY-100635與8-OH-DPAT聯(lián)合應(yīng)用則消除了8-OH-DPAT的效應(yīng),提示所觀察到的8-OH-DPAT的效應(yīng)是通過5-HT<,lA>受體起作用的.此外,8-OH-DPAT能調(diào)節(jié)與運(yùn)動并發(fā)癥密切相關(guān)的GluR1的亞細(xì)胞分布,且使G1uRlSer831、GluRlSer845的磷酸化水平明顯降低.上述研究表明,8-oH-DPAT是通過5-HT<,lA>受體起作用的,激動5-HT<,lA>,受體的藥物可能對于帕金