α-synuclein基因在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、該研究采用基因工程手段,進(jìn)行了人α-synuclen(h α-synuclein)基因cDNA的克隆,構(gòu)建了野生型和突變型hα-synuclein的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1/hα-synuclein(wt/mut),將hα-synuclein基因轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞使其過(guò)表達(dá),并在此基礎(chǔ)上觀察hα-synuclein過(guò)度表達(dá)引起細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,比較野生型和突變型hα-synuclein過(guò)表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用及其對(duì)蛋白酶體抑制劑

2、的毒性易感性,初步探討了α-synuclein基因在PD發(fā)病機(jī)制中的作用,為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ).該課題分三個(gè)部分第一部分:野生型和突變型α-synuclein真核表達(dá)載體構(gòu)建采用RT-PCR從人胚腦組織中擴(kuò)增人α-synuclein基因,構(gòu)建至真核表達(dá)載體pEGFP-N1中,再采用重疊延伸法(SOE法)定點(diǎn)突變,構(gòu)建了突變型α-synuclein基因真核表達(dá)載體.結(jié)果表明所得到的片段與報(bào)道序列的同源性達(dá)100﹪(突變型達(dá)99﹪),并且

3、成功地將片段克隆到了真核表達(dá)載體上.第二部分:野生型和突變型hα-synuclein在PC12細(xì)胞中的表達(dá)將已構(gòu)建的pEGFP-N1/hα-synuclein(wt/mut)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,Western-blot法證實(shí)細(xì)胞內(nèi)有hα-synuclein(wt/mut)融合蛋白表達(dá).野生型和突變型hα- synuclein瞬時(shí)表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯影響,它們廣泛分布于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中,與內(nèi)源性α-synuclein的分布相

4、一致;采用MTT比色法證實(shí)A30P突變型hα-synuclein對(duì)PC12細(xì)胞有毒性作用;用磷脂酰絲氨酸外翻分析(AnexinV)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)突變型α-synuclein基因瞬時(shí)表達(dá)能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡.第三部分Lactacystin對(duì)過(guò)表達(dá)α- synucleinPC12細(xì)胞的毒性作用采用MTT法檢測(cè)蛋白酶體抑制劑Lactacysth對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響,加入Lactacystin24小時(shí)后,PC12細(xì)胞活性明顯下降,呈劑量