CD59基因突變與蛋白質(zhì)糖基化相關(guān)性的研究.pdf

1、目的 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得兩種突變CD59真核表達(dá)分子,探討其糖基化前后抗補(bǔ)體活性的變化,為糖尿病血管增殖癥的發(fā)生機(jī)制提供理論基礎(chǔ).方法 采用基因定點(diǎn)突變技術(shù)在CD59易于糖基化的位點(diǎn)K41--H44將H44基因位置改變,構(gòu)建兩種不同的CD59突變基因,各設(shè)計(jì)兩條互補(bǔ)突變引物和兩條常規(guī)引物,以已構(gòu)建CD59cDNA重組質(zhì)粒為模板,重組PCR定點(diǎn)誘變擴(kuò)增突變基因,EcoRI酶切重組入真核表達(dá)質(zhì)粒pALTER-MAX.利用陽離子脂質(zhì)體(Lip

2、ofectamine-2000)將重組質(zhì)粒和pcDNA3共轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary,CHO)進(jìn)行表達(dá).G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆,熒光免疫組化(FIH)、酶免疫組化(EIH)、流式細(xì)胞儀法(FACS)和免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測篩選CD59突變基因蛋白高表達(dá)株.染料釋放實(shí)驗(yàn)初步檢測突變CD59蛋白糖基化前后抗補(bǔ)體活性的變化情況.大量擴(kuò)增收獲高表達(dá)細(xì)胞備用.結(jié)果 PCR定點(diǎn)誘變成

3、功獲得目的CD59突變基因,序列測定及酶切鑒定均證實(shí)成功構(gòu)建了pALTER-MAX-突變CD59重組真核表達(dá)載體系統(tǒng),突變基因長度約500bp.Lipofectamine-2000將重組質(zhì)粒和pcDNA3共轉(zhuǎn)染導(dǎo)入真核受體細(xì)胞CHO,G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆.經(jīng)FIH、EIH、FACS成功檢測并鑒定出較高表達(dá)突變CD59分子的陽性細(xì)胞克隆HM3和HM4.Western blot檢測出陽性細(xì)胞克隆裂解液中有一條約20KD的CD59

4、蛋白表達(dá)帶.染料釋放實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)突變CD59分子具有抗補(bǔ)體活性,糖基化后抗補(bǔ)體活性明顯降低.大量擴(kuò)增收獲陽性細(xì)胞克隆以備進(jìn)一步測定突變CD59功能及制備抗突變CD59 McAb.結(jié)論 以突變CD59基因和pALTER-MAX質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的真核表達(dá)體系構(gòu)建成功,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入真核細(xì)胞并獲得膜表面突變CD59分子的表達(dá),表達(dá)突變CD59分子具有抗補(bǔ)體活性,但易被糖基化,糖基化后抗補(bǔ)體活性明顯降低,為進(jìn)一步研究糖尿病血管增殖癥的