鈣磷骨水泥-杜仲葉提取物復合材料的研制和體內(nèi)外活性研究.pdf

1、本研究擬將杜仲葉提取物與磷酸鈣骨水泥(CPC)進行有效的復合，制備成形態(tài)可預制的復合載體，并對其理化性能、體內(nèi)外生物活性進行分析測試，旨在評價CPC/杜仲葉提取物復合材料修復頜面部骨缺損的效果和可行性。 研究方法： 1、復合材料的研制：通過二次煅燒牛骨和加入0.3M磷酸氫二銨(AP)的方法獲得羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(HAP/β-TCP)兩相骨水泥，采用醇提水沉法并通過高效液相色譜法(HPLC法)提取和測定杜仲葉水溶性活

2、性物質(zhì)，并將兩者有效復合。采用凝固時間、抗壓強度、水中溶解度和PH值、孔隙率的測定，以及掃描電鏡觀察、X射線衍射分析(XRD)和傅里葉紅外光譜分析(FTIR)，對復合材料的理化特性進行檢測。 2、復合材料體外生物活性研究：分別將含0、0.152、0.304、0.608mg/ml杜仲葉提取物的復合材料塊與大鼠成骨樣細胞(MC3T3-E1細胞)體外DMEM培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)48小時，通過對同位素3H-TdR摻入試驗測定細胞增殖以及用倒

3、置顯微鏡和掃描電鏡觀察成骨細胞在材料周圍和表面的生長、增殖、附著情況，以評價此復合材料的細胞相容性，并確定動物實驗中與CPC復合的最佳杜仲葉提取物的濃度。 3、復合材料體內(nèi)生物活性研究：根據(jù)體外活性測試的結(jié)果，選擇最佳杜仲葉提取物濃度，與CPC復合形成CPC/杜仲葉提取物復合人工骨。制作兔顱骨缺損模型(3個9mm大小的孔型顱骨缺損)，分別植入CPC/杜仲葉提取物復合人工骨、純CPC人工骨和空白對照，共計9只兔子。分別在4、8、1

4、2周各處死3只兔子，切取標本，數(shù)字×線、常規(guī)HE組織切片和掃描電鏡觀察材料在動物體內(nèi)的組織相容性和生物活性。 研究結(jié)果： 1、本研究所制備的CPC經(jīng)XRD測定為HAP、βTCP兩個晶相，復合物的凝固時間為8～9分鐘，符合臨床操作要求，復合一定濃度的杜仲葉提取物不影響CPC的凝固時間及抗壓強度，抗壓強度為19Mpa左右，適合非負重骨缺損的修復；CPC在水中的溶解度為2.34％；水中PH值在6.8～7.5之間，適合成骨細胞生

5、長的要求；CPC孔隙率為31.3％，掃描電鏡下觀察到材料呈疏松的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑5～100μm之間；XRD和FTIR分析發(fā)現(xiàn)復合一定濃度的杜仲葉提取物不影響CPC的理化性能，杜仲葉提取物是以無定形形式存在于CPC材料中。 2、CPC/杜仲葉提取物復合材料與大鼠MC3T3-E1成骨樣細胞共同培養(yǎng)中，成骨細胞生長活躍，未出現(xiàn)大量細胞死亡及中毒現(xiàn)象。成骨細胞在24小時內(nèi)即貼壁生長，細胞形態(tài)與傳代前一致，特別是0.304mg/ml組培養(yǎng)4

6、8小時后可見材料周圍細胞生長旺盛，呈不規(guī)則多角形，相互重疊，連接成網(wǎng)絡狀生長。同位素摻入試驗顯示培養(yǎng)48小時，復合0.304mg/ml濃度杜仲葉提取物的CPC對成骨細胞的增殖作用最強。0.304mg/ml組培養(yǎng)48小時后掃描電鏡下可見成骨細胞在材料表面大量增殖，覆蓋了大部分材料表面，呈多角扁平形，密集處可見細胞復層生長，細胞間突觸接觸多而緊密，表明CPC/杜仲葉提取物復合材料具有顯著促進成骨細胞增殖的作用。 3、將此濃度的復合材

7、料植入兔顱骨缺損模型，并與不含杜仲的CPC對照研究，連續(xù)觀察3個月，無一例出現(xiàn)急性排斥反應，X線及掃描電鏡觀察，可見人工骨與骨組織間隙逐漸模糊、縮小，與骨組織連接逐漸緊密，陰影處密度逐漸增加。實驗組8周時已與骨組織連接緊密，邊緣部分隱約可見骨紋理，12周時材料邊緣模糊，骨組織部分長入材料內(nèi)；組織學檢查表明隨著時間的推移，膠原纖維逐漸鈣化，新生骨小梁從邊緣向材料內(nèi)部生長，骨新生活躍，有骨島形成，12周時達到骨性連接，并有血管化生成。而對照