GSTM1, GSTT1, GSTP1, GSTA1和NQO1基因多態(tài)性與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變無關.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見的微血管病變之一,是工作年齡成人致盲的主要原因。氧化應激在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生中起重要作用,是由于活性氧生成和清除不平衡的結果。谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase, GST)是一組普遍存在于各種生物體內(nèi)的Ⅱ相代謝酶,在包括環(huán)境致癌物、化療藥物、活性氧等許多內(nèi)源性和外源性物質的代謝和解毒方面起重要作用。研究得最多的谷胱甘肽硫轉移酶多態(tài)性包括GSTM1基因缺失多態(tài)性、GSTT

2、1基因缺失多態(tài)性和GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性。GSTM1和GSTT1基因的純合缺失則失去各自酶的活性。GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性是在313位的1個A到G的轉換,對應蛋白質的105位氨基酸由異亮氨酸變?yōu)槔i氨酸,酶活性降低。GSTA1也是重要的谷胱甘肽硫轉移酶之一,在肝臟的含量最多。在GSTA1基因的啟動子區(qū)有3個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP),組合在一起產(chǎn)生兩

3、種變異:GSTA1*A(-567T,-69C,-52G)和 GSTA1*B(-567G,-69T,-52A)。具有GSTA1*B的個體的GSTA1在肝臟表達降低。因為這3個SNP位點緊密連鎖,對-69位點的酶切分型即可區(qū)分GSTA1*A和GSTA1*B。GSTM1基因、GSTT1基因、GSTP1基因、GSTA1基因的缺失基因型或低活性基因型與血液透析患者和癌癥患者的氧化損傷相關。NQO1是1種能還原活性氧的蛋白質,從而能保護細胞。NQO

4、1的活性與其多態(tài)性密切相關。位于NQO1 cDNA609位核苷酸的C到T替換使其對應蛋白質的187位氨基酸由脯氨酸轉變?yōu)榻z氨酸,顯著降低酶的活性。對GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性、GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性、GSTA1基因C-69T多態(tài)性和NQO1基因C609T多態(tài)性的研究主要集中在腫瘤方面。關于這5個多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究不多,得到的結果也不一致。目前,還沒有GSTA1基因C-69T多態(tài)性和NQO1基因C60

5、9T多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變之間關系的報道。在我國還沒有這5個多態(tài)性位點與糖尿病視網(wǎng)膜病變之間關系研究的報道。
　　為了更好地理解GSTM1, GSTT1, GSTP1, GSTA1和 NQO1在我國2型糖尿病視網(wǎng)膜病變形成中的作用,我們開展了本研究。此外,考慮到GSTT1和GSTM1基因缺失多態(tài)性、GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性通常是一起被研究,而它們又是用不同的方法分別研究,有必要建立1種簡單、可靠的方法來同時對這3個

6、多態(tài)性進行檢測。
　　目的:
　　1、建立一種簡單、可靠的能同時檢測GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性、GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性的方法。
　　2、研究GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性、GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性GSTA1基因C-69T多態(tài)性和NQO1基因C609T多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變之間的關系。
　　方法:
　　1、建立同時檢測GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性、GST

7、P1基因Ile105Val多態(tài)性的方法時用了259例志愿者。首先從全血里提取了基因組DNA并稀釋為10ng/μl。接下來是建立GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性四引物擴增受阻突變體系PCR檢測的方法,最后在GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性四引物擴增受阻突變體系PCR的基礎上對多重PCR同時檢測GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性、GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性的條件進行優(yōu)化。用GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性多重P

8、CR法和GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性的測序法對多重PCR同時檢測GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性、GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性的結果進行驗證。
　　2、在研究GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性、GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性、GSTA1基因C-69T多態(tài)性和NQO1基因C609T多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變之間的關系時用了546例2型糖尿病樣本。病人全部來自南昌大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科。根據(jù)眼底檢查的

9、結果把病人分成2組:糖尿病視網(wǎng)膜病變組(DR組),包括85名男性和73名女性,平均年齡58.34±10.64歲,有糖尿病但沒有視網(wǎng)膜病變組(NDR組),包括216名男性和172名女性,平均年齡60.08±11.45歲。所有患者都是無親屬關系的漢族人。測量身高、體重、血壓,計算體重指數(shù)。檢測并記錄患者的空腹血糖、餐后2小時血糖、糖化血紅蛋白、膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、尿素氮、肌酐、尿酸水平。記錄糖尿病病程。

10、GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性、GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性的檢測用多重PCR的方法。GSTA1基因C-69T多態(tài)性和NQO1基因C609T多態(tài)性的檢測用構象差異凝膠電泳的方法。所有多態(tài)性的分型結果用其他的分型方法進行驗證以保證結果的準確性。Hardy-Weinberg平衡檢驗采用?2檢驗。比較5個多態(tài)性各基因型在DR組和NDR組的分布情況。比較DR組和NDR組的臨床資料之間的差異。單變量分析顯示有差異的變量進行l(wèi)ogi

11、sitic回歸分析DR的危險因素。實驗數(shù)據(jù)用SPSS20.0軟件進行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、在GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性四引物擴增受阻突變體系PCR的基礎上,建立了單管多重PCR同時檢測GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性、GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性的方法。該方法可以降低檢測成本,縮短檢測時間。該多重PCR對GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性、GSTP1基因Il

12、e105Val多態(tài)性的分型結果分別與GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性多重PCR的檢測結果和GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性的DNA測序結果一致。
　　2、5個多態(tài)性的分型結果清楚,與確認的分型方法結果一致。GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性、GSTA1基因C-69T多態(tài)性和NQO1基因C609T多態(tài)性的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。統(tǒng)計學分析顯示GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性、GSTP1基因I

13、le105Val多態(tài)性、GSTA1基因 C-69T多態(tài)性和NQO1基因C609T多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生均無關,P值分別為0.822、0.449、0.639、0.561和0.713。臨床資料分析顯示糖尿病病程在DR組更長,尿素氮、肌酐和尿酸水平在DR組更高。非條件logisitic回歸分析顯示糖尿病病程和血尿素氮水平是DR的獨立危險因素。
　　結論:
　　1、基于GSTP1基因Ile105Val多態(tài)性四引物擴增受阻突變