PCR在啤酒廠快速鑒定啤酒有害菌的應用研究.pdf

1、本文的研究工作主要內(nèi)容分4個部分： 首先對啤酒廠啤酒釀造過程及環(huán)境中有害菌的分布及種類進行了研究。在啤酒廠，從麥汁、發(fā)酵液、清酒、儲存酵母、設備表面、成品啤酒中共分離到112株可在厭氧環(huán)境條件在NBB培養(yǎng)基中生長的細菌。經(jīng)過對這112株細菌對啤酒的腐敗試驗，確定其中44株為啤酒有害菌。通過對這44株有害菌進行梅里埃生理生化鑒定、16srDNA序列分析、產(chǎn)乳酸試驗等，得知這44株有害菌分屬于以下2個屬的8種乳酸菌： Leu

2、conostocpseudomesenteroides、Leuconostoccitreum、Lactobacilluscollinordes、Lactobacillusbrevis、Lactobacillusfructivorans、Lactobacillusparacasei、Lactobacillusplantarum、Lactobacillusacetotolerans。 其次，以細菌16srDNA為基礎，對有害菌快速鑒

3、定進行了研究。根據(jù)文獻記載以及本研究所確定的有害菌種類，從Genebank中下載有害菌所在屬的63種細菌的16srDNA序列，用DNAstar軟件進行序列對比分析，找出這63種細菌16srDNA序列所共有的5條同源序列，以這5條同源序列為基礎設計出一對適合所有有害菌的通用引物：上游：5’-GAACAGGATTAGATACCC-3’，下游：5’-GACTTAACCCAACATCTCAC-3’。利用該對引物，可以檢測出啤酒廠出現(xiàn)的8種有害菌

4、，而對啤酒中常出現(xiàn)的13種非有害菌則不能檢出，保證了該引物對啤酒有害菌的特異性。 以抗酒花基因horA為基礎對有害菌快速鑒定進行了研究。由于啤酒有害菌大多為乳酸菌，根據(jù)文獻研究所得出的結(jié)論：啤酒乳酸菌大多含有抗酒花基因horA，利用以horA基因為基礎設計的引物LbHC-1：5’-ATCCGGCGGTGGCAAATCA-3'和LbHC-2:5'-AATCGCCAATCGTTGGCG-3’對有害菌進行快速鑒定。PCR反應條件為：在

5、25μLPCR反應體系中，加入濃度為10μM的引物LbHC-1和LbHC-2各1μL，10×PCR反應緩沖液(含Mg2+)3μL，混合ddNTP0.8μL，TaqE(5U/μL)0.4μL，DNA5μL，雙蒸水13.8uL。循環(huán)體系：首輪循環(huán)94℃變性3min，接著以94℃1min，55℃2min，72℃30sec進行25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1％低瓊脂糖凝膠電泳檢測。凝膠PCR所需時間總共為4小時。由于PCR檢測有害菌存在細胞檢測靈敏度

6、問題，因此在檢測之前必須對啤酒樣品進行富集增菌培養(yǎng)，使細胞數(shù)達到可以檢測出的水平。富集培養(yǎng)是啤酒有害菌快速檢出的門檻及瓶頸，富集培養(yǎng)所需的時間越短，檢測所需總時間就越短，檢測效率就越高。本研究比較了4種培養(yǎng)基的增菌效果，其中MRS增菌速度最快。對有害菌培養(yǎng)的最適溫度是30℃。在MRS培養(yǎng)基中添加生長因子D-泛酸、菸酸胺、煙酸、葉酸、VB12、生物素、VB6、VB1、核黃素，觀察對啤酒有害菌增殖的效果。結(jié)果顯示：添加100mg/L葉酸的M

7、RS培養(yǎng)基比不加葉酸的MRS培養(yǎng)基對8種有害菌株的生長有明顯的促進作用。實驗還表明：PCR檢測有害菌細胞的靈敏度為3～70個細胞(CFU)，而用MRS培養(yǎng)基加100mg/L葉酸對樣品進行富集，可以使一個有害菌細胞在培養(yǎng)16小時后超過70個。另外，細菌質(zhì)粒DNA提取方法對檢測時間及靈敏度的影響也進行了研究。在抽提法、煮沸法、凍融法、菌體直接PCR等4種提取方法中，除菌體直接PCR不能檢出有害菌外，抽提法、煮沸法、凍融法都可檢測出有害菌，且

8、3種方法檢測的靈敏度一致，但煮沸法較抽提法和凍融法更省時，更經(jīng)濟，更環(huán)保。用添加了100mg/L葉酸的MRS培養(yǎng)基增殖細胞，用煮沸法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)凝膠PCR檢測，所需時間總共不超過24小時。將凝膠PCR方法應用于生產(chǎn)線上的純生啤酒有害菌檢測，結(jié)果表明：與用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)計數(shù)方法檢測相比，結(jié)果的一致率達到99.7％。凝膠PCR方法比傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)計數(shù)方法有更高靈敏度。 最后對可過濾樣品和不可過濾樣品的預處理進行了研究。對于可過