不同粒徑納米氧化鋁致神經(jīng)細胞死亡方式的研究.pdf

1、[目的]：通過體外實驗研究不同粒徑納米氧化鋁誘導神經(jīng)細胞死亡的方式，并且初步探討其主要的死亡方式。
　　 [方法]：1.觀查10nm氧化鋁和50nm氧化鋁粒子在溶液中的分散情況以及微米鋁顆粒和納米碳顆粒進入細胞的情況：1）將50nmAl2O3，10nmAl2O3儲存液超聲10分鐘，在電鏡下觀察其分散情況；2）10nm-C，10μmAl2O3染毒細胞，終濃度為500μmM，觀察顆粒進入細胞的情況。2.納米氧化鋁對神經(jīng)細胞活力及死亡

2、方式的形態(tài)學觀察：1）原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞，染毒，設(shè)空白對照組，10nm-C組，AlCl3鋁，10μmAl2O3組,50nmAl2O3組，10nmAl2O3組，染毒濃度為0.5mM繼續(xù)培養(yǎng)48h；2）檢測細胞活力；3）顯微鏡下觀察細胞；4)AO-EB雙染，觀察細胞凋亡與壞死；5）MDC染色觀察細胞自噬。3.透射電鏡確定納米氧化鋁誘導神經(jīng)細胞的死亡方式：1）細胞培養(yǎng)，染毒；2）收集細胞，制作電鏡標本：3)電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。4.細胞凋亡與

3、壞死的檢測：1）Annexin-V/7-AAD雙染法檢測神凋亡率與壞死率；2）分別檢測凋亡相關(guān)基因Caspase-3，Cyt-c和壞死相關(guān)基因Rip1，Nf-kB的表達情況。5.自噬的檢測：1）檢測自噬小體的發(fā)生情況；2)檢測自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ和Atg-5的表達。6.染毒后分別加入凋亡特異性抑制劑zVAD-fmk，壞死特異性抑制劑Nec-1，自噬特異性抑制劑3-MA，分別檢測細胞活力。
　　 [結(jié)果]：1.觀查10nm氧化鋁

4、和50nm納米氧化鋁粒子超聲后在溶液中的分散情況以及微米鋁顆粒和納米碳顆粒進入細胞情況：1）納米氧化鋁經(jīng)超聲混勻后靜置前后納米顆粒的形狀及分散程度沒有明顯變化，符合實驗染毒要求；2）納米碳和微米氧化鋁顆粒均可以進入神經(jīng)細胞。2.納米氧化鋁對神經(jīng)細胞活力及死亡方式的形態(tài)學觀察：1）染毒細胞活力均有明顯下降(P＜0.05)，且隨著氧化鋁粒徑的減小，細胞活力逐漸降低。2)鏡下觀察正常對照組和AlCl3組的細胞大小形態(tài)均一，胞膜完整，胞質(zhì)豐滿，

5、細胞連接豐富：10nm-C組和10μmAl2O3組，細胞減少，胞間連接減少甚至消失，胞膜破裂、胞質(zhì)濃縮，但細胞體基本完整，突觸變短，但清晰可見；50nmAl2O3組和10nmAl2O3組細胞數(shù)目少，細胞間連接中斷，細胞腫脹和細胞皺縮并存，細胞體不完整，突觸消失，且10nmAl2O3染毒組，細胞崩解，碎裂。3)AO-EB染色神經(jīng)細胞，可見正常對照組神經(jīng)細胞呈綠色的均勻熒光，有較多的軸突和樹突，沒有凋亡或壞死的細胞，10nm-C組和10nm

6、Al2O3組神經(jīng)細胞數(shù)量減少，染色質(zhì)聚集，固縮呈較濃的黃綠色，看到少量的凋亡和壞死細胞，在50nmAl2O3組、10nmAl2O3組有些神經(jīng)細胞的胞核染成鮮紅色或桔紅色熒光，并且胞漿也染成淡紅色，部分細胞結(jié)構(gòu)不清或溶解，胞膜破裂，細胞崩解，大量的凋亡和壞死細胞。4）正常對照組和AlCl3組，僅見到少量的MDC陽性細胞，并且每個細胞中含的AV數(shù)量很少；10nm-C組和10μmAl2O3組，MDC陽性細胞數(shù)明顯增加，每個細胞中AV數(shù)量也較多

7、；50nmAl2O3組和10nmAl2O3組細胞數(shù)目少，胞體變圓，變大，MDC陽性細胞布滿視野，且充溢著大量AV。3.電子顯微鏡下驗證納米氧化鋁誘導神經(jīng)細胞的死亡方式：通過對染毒后神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察可以確定其死亡方式有凋亡，壞死和自噬。4.細胞凋亡與壞死的檢測：1）空白組相比，10umAl2O3組、50nmAl2O3組和10nmAl2O3組的細胞凋亡率與壞死率顯著增加，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且隨著納米氧化鋁粒徑的減小，凋亡

8、率與壞死率有遞增的趨勢。2）與空白組比，染毒組的凋亡相關(guān)基因Caspase-3，Cyt-c，壞死相關(guān)基因Rip1，Nf-kB表達均有變化，具有統(tǒng)計學意義，且具有粒徑依賴性。5.自噬的檢測：1）與空白對照組相比，10umAl2O3組、50nmAl2O3組和10nmAl2O3組的細胞自噬小泡數(shù)量增加，平均熒光強度峰值向右偏移(P＜0.05)，且隨著納米氧化鋁粒徑的減小，自噬率有遞增的趨勢。2）與對照組相比，染毒組自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ，AT