不同粒徑納米氧化鋁遺傳毒性的研究.pdf

1、目的:通過Ames試驗(yàn)、彗星試驗(yàn)、小鼠骨髓微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)，從基因水平、DNA水平及染色體水平對(duì)不同粒徑納米氧化鋁致遺傳毒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并初步探討其作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、細(xì)菌回復(fù)突變(Ames)試驗(yàn)
　　 (1)實(shí)驗(yàn)前對(duì)納米氧化鋁(13nm和50nm)顆粒進(jìn)行表征用Image-pro plus圖像分析軟件進(jìn)行粒徑分析，nano-ZS90納米粒度儀進(jìn)行電位分析。
　　 (2)Ame

2、s試驗(yàn)通過加和不加肝S9混合物條件下，采用組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌(TA97、TA98、TA100、TA102菌株)進(jìn)行細(xì)菌的回復(fù)突變(Ames)實(shí)驗(yàn)。選用納米氧化鋁(13nm和50 nm)及微米氧化鋁(10μm)三個(gè)粒徑組，設(shè)空白對(duì)照組、溶劑(DMSO)對(duì)照組、0.0005 mg/皿、0.005 mg/皿、0.05 mg/皿、0.5 mg/皿、5 mg/皿、陽性對(duì)照組。
　　 (3)細(xì)菌氧化應(yīng)激指標(biāo)選用谷胱甘肽(GSH)、超

3、氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒評(píng)估細(xì)菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　 2、彗星試驗(yàn)
　　 (1) IC50的測定，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×104個(gè)/ml，均勻接種到六孔板中，細(xì)胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度的納米氧化鋁(13nm和50 nm)及微米氧化鋁(10μm)的新培養(yǎng)液，其終濃度為0、1.5、3.0、6.2、12.5、25、50、100μg/ml，共八個(gè)劑量組。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平

4、行樣。作用24h后，去除各孔中的培養(yǎng)液，用D-Hank's液洗2遍，用0.25％胰酶消化細(xì)胞后，制成單細(xì)胞懸液。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)各孔的存活細(xì)胞數(shù)，取均值，計(jì)算抑制率，重復(fù)3次。并用概率單位法求出各尺寸氧化鋁的半數(shù)抑制濃度IC50。
　　 (2)熒光標(biāo)記納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞情況觀察取cy5.5熒光標(biāo)記的納米氧化鋁顆粒(13nm)、納米氧化鋁顆粒(50 nm)、微米氧化鋁顆粒(10μm)染毒細(xì)胞，染毒終濃度為30μg/ml，染毒3h時(shí)用

5、Hoechst熒光染液加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，終濃度為5μg/ml，15分鐘后用D-Hank's液清洗2次，在熒光顯微鏡下觀察不同粒徑納米氧化鋁顆粒進(jìn)入細(xì)胞情況并拍照。
　　 (3)單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳(SCGE)試驗(yàn)選用納米氧化鋁顆粒(13nm和50 nm)、微米氧化鋁顆粒(10μm)三個(gè)粒徑組，設(shè)空白對(duì)照組、低劑量（15μg/ml）、中劑量(30μg/ml)、高劑量(60μg/ml)和陽性對(duì)照組(絲裂霉素C0.5μg/ml)，染毒

6、12、24、48h后處理細(xì)胞。用單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳(SCGE)檢測DNA損傷，以O(shè)live尾距值評(píng)價(jià)DNA損傷程度;
　　 (4)細(xì)胞的氧化應(yīng)激指標(biāo)選用谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒評(píng)估細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　 3、小鼠骨髓微核試驗(yàn)
　　 將55只雄性和55只雌性ICR小鼠隨機(jī)分為11組，每組5只，選用納米氧化鋁顆粒(13 nm和50 nm)、

7、微米氧化鋁顆粒(10μm)三個(gè)粒徑組，設(shè)空白對(duì)照組、低劑量(300mg/kg)、中劑量(600 mg/kg)、高劑量(1200 mg/kg)和陽性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺40 mg/kg)，用腹腔注射方式染毒。留取骨髓涂片，計(jì)數(shù)微核率。
　　 4、小鼠精子畸形試驗(yàn)
　　 (1)小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)55只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為11組，每組5只，選用納米氧化鋁顆粒(13 nm)、納米氧化鋁顆粒(50 nm)、微米氧化鋁顆粒(10μm)三

8、個(gè)粒徑組，設(shè)空白對(duì)照組、低劑量（300 mg/kg）、中劑量(600 mg/kg)、高劑量(1200 mg/kg)和陽性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺40 mg/kg)，用腹腔注射對(duì)動(dòng)物連續(xù)五天進(jìn)行染毒。第35天脫臼處死會(huì)取附睪及睪丸，計(jì)數(shù)精子畸形率。
　　 (2)睪丸病理形態(tài)學(xué)將一側(cè)睪丸置于4％中性福爾馬林溶液中固定24h后，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋、切片(切片厚約4mm)。再依次HE染色、封片、鏡檢并攝片。
　　 (3)小鼠睪丸氧

9、化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)選用谷胱甘肽氧化酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒評(píng)估睪丸的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　 結(jié)果:
　　 1、細(xì)菌回復(fù)突變(Ames)試驗(yàn)
　　 (1)納米氧化鋁顆粒表征
　　 納米氧化鋁13nm、50 nm的平均粒徑分別為20.9±9.5nm、112.4±9.1 nm，Zeta電位分別為49.4±2.2 mV、44.3±9.1 mV.

10、r>　　 (2) Ames試驗(yàn)
　　 納米氧化鋁及微米氧化鋁回復(fù)突變?cè)囼?yàn)非活化平板摻入試驗(yàn)中，陽性對(duì)照組菌株的回變菌落數(shù)增加，并超過空白對(duì)照組的2倍以上，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，溶劑對(duì)照組與小于空白對(duì)照組細(xì)菌回變數(shù)的2倍。納米氧化鋁(13nm、50nm)及微米氧化鋁(10μm)劑量組中各菌株細(xì)菌回變菌落數(shù)小于空白對(duì)照組細(xì)菌回變數(shù)的2倍。
　　 納米氧化鋁及微米氧化鋁回復(fù)突變?cè)囼?yàn)活化平板摻入試驗(yàn)中，陽性對(duì)照組

11、菌株的回變菌落數(shù)明顯增加，特別是菌株TA97、TA98、TA100，并超過空白對(duì)照組的2倍以上，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)菌回變數(shù)的2倍。納米氧化鋁(13 nm、50 nm)和微米氧化鋁(10μm)劑量組中各菌株細(xì)菌回變菌落數(shù)小于空白對(duì)照組細(xì)菌回?cái)?shù)的2倍。
　　 (3)細(xì)菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)測定
　　 在加肝S9混合物情況下，納米氧化鋁(13nm、50 nm)和微米氧化鋁(10μm)劑量

12、組中各菌株的GSH、SOD、MDA、T-AOC測定值，與空白對(duì)照組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 2、彗星試驗(yàn)
　　 (1) IC50測定根據(jù)概率單位法計(jì)算出納米氧化鋁(13 nm) IC50為56.75μg/ml、納米氧化鋁(50 nm) IC50為44.06μg/ml、微米氧化鋁（10μm）IC50為64.27μg/ml。為了便于各粒徑組之間比較，統(tǒng)一染毒劑量，高劑量為60μg/ml、中劑量為30μg/m

13、l、低劑量為15μg/ml。
　　 (2)熒光Hoechst染色可見CHL細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻藍(lán)染的熒光。Cy5.5熒光標(biāo)記氧化鋁顆粒為紅色顆粒。融合圖為Hoechst染色圖和熒光標(biāo)記氧化鋁圖組合，納米氧化鋁顆粒染毒組可見較多的熒光標(biāo)記的納米顆粒進(jìn)入胞質(zhì)，微米氧化鋁顆粒組較少。
　　 (3)單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳(SCGE)結(jié)果空白對(duì)照組彗星頭部DNA致密，無明顯尾部或尾部很短。各染毒組頭部DNA集中，亮度較強(qiáng)，尾部由DN

14、A斷片組成呈掃帚狀，熒光強(qiáng)度不及頭部。劑量效應(yīng):在染毒12、24、48h，隨著染毒劑量增加，與空白對(duì)照組相比，不同粒徑組的低、中、高劑量組Olive尾矩有增加趨勢，高劑量組增加明顯，與中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。時(shí)間效應(yīng):，納米氧化鋁(13nm)組、納米氧化鋁(50 nm)組和微米氧化鋁(10μm)組Olive尾矩，隨著染毒時(shí)間延長，有增加趨勢，48h時(shí)各粒徑組Olive尾矩與12、24h之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、意義(P＜0.05)，24h與12h之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。粒徑效應(yīng):48h時(shí)，納米氧化鋁(50 nm)組Olive尾矩與納米氧化鋁(13 nm)組和微米氧化鋁(10μm)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (4)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)水平測定
　　 谷胱甘肽(GSH)測定結(jié)果，劑量效應(yīng):在染毒24、48h時(shí)，隨著染毒劑量增加，與空白對(duì)照組相比，不同粒徑組的低、中、高劑量組GSH有減少趨勢，中、高劑量

16、組GSH與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。時(shí)間效應(yīng):，納米氧化鋁(50nm)組GSH，隨著染毒時(shí)間延長，有減少趨勢，48h與12、24h之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），12h與24h之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。粒徑效應(yīng):48h時(shí)，納米氧化鋁(50 nm)組GSH與納米氧化鋁(13 nm)組和微米氧化鋁(10μm)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 超氧化物歧化酶(SOD)測

17、定結(jié)果，劑量效應(yīng):，在染毒12、24h時(shí)，隨著染毒劑量增加，納米氧化鋁（13 nm）組及微米氧化鋁(10μm)的低、中、高劑量組SOD與空白對(duì)照組相比，有減少趨勢，高劑量組SOD與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。納米氧化鋁(50 nm)組的低、中劑量組SOD與空白對(duì)照組有升高趨勢。在染毒48h時(shí)，隨著染毒劑量增加，不同粒徑組的低、中、高劑量組SOD與空白對(duì)照組相比，有減少趨勢，納米氧化鋁(13 nm)組、納米氧

18、化鋁(50 nm)組及微米氧化鋁(10μm)中、高劑量組SOD與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。時(shí)間效應(yīng):，納米氧化鋁(13 nm)組、納米氧化鋁(50 nm)組及微米氧化鋁(10μm)組SOD，隨著染毒時(shí)間延長，有減少趨勢，48h與12h之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。粒徑效應(yīng):48h時(shí)，納米氧化鋁(50 nm)組SOD與納米氧化鋁(13 nm)組和微米氧化鋁(10μm)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。納米氧

19、化鋁(13 nm)組與微米氧化鋁(10μm)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 丙二醛(MDA)測定結(jié)果，劑量效應(yīng):，在染毒12、24、48h時(shí)，隨著染毒劑量增加，各粒徑組的低、中、高劑量組MDA與空白對(duì)照組相比，有增加趨勢，納米氧化鋁(13 nm、50nm)組及微米氧化鋁（10μm）組的中、高劑量組MDA與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。時(shí)間效應(yīng):在納米氧化鋁(13 nm)組隨著染毒時(shí)間延長，有增加趨勢

20、，48h與12h、24h之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，24h與48h之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。納米氧化鋁(50 nm)組與微米氧化鋁(10μm)組MDA隨著染毒時(shí)間延長，有增加趨勢，48h與12h、24h之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），24h與48h之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。粒徑效應(yīng):24h時(shí)納米氧化鋁(50nm)組MDA與納米氧化鋁(13 nm)組和微米氧化鋁(10μm)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

21、＜0.05)。48h時(shí)，納米氧化鋁(13 nm)組和納米氧化鋁(50 nm)組MDA與微米氧化鋁（10μm）組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，但納米氧化鋁(13nm)組和納米氧化鋁(50nm)組之間差異有差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 總抗氧化能力(T-AOC)測定結(jié)果，劑量效應(yīng):在染毒24、48h時(shí)，隨著染毒劑量增加，不同粒徑組的低、中、高劑量組T-AOC與空白對(duì)照組相比，有減少趨勢，納米氧化鋁

22、(13nm)組、納米氧化鋁(50 nm)組及微米氧化鋁(10μm)中、高劑量組T-AOC與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。時(shí)間效應(yīng):不同粒徑組的T-AOC，隨著染毒時(shí)間延長，有減少趨勢，納米氧化鋁(13 nm)組、納米氧化鋁(50nm)組12h與48h之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。粒徑效應(yīng):48h時(shí)，納米氧化鋁(50 nm)組T-AOC與納米氧化鋁(13nm)組和微米氧化鋁（10μm）組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

23、05)。
　　 3、小鼠骨髓微核試驗(yàn)
　　 在雌性組和雄性組中，與空白對(duì)照組相比，各粒徑組不同劑量間的微核率均小于2‰。
　　 4、小鼠精子畸形試驗(yàn)
　　 (1)小鼠精子畸形率正常小鼠精子畸形率在0.8％-3.4％之間，各粒徑組的空白對(duì)照組及低、中劑量組均在正常范圍，高劑量組在正常范圍之外，與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。但各粒徑組的高劑量組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)
　　

24、 (2)小鼠睪丸病理變化空白對(duì)照組和低劑量組的各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量多，層次清晰。中劑量組管壁上的生精細(xì)胞較少，層次稍微減少，排列紊亂。高劑量組管壁上的生精細(xì)胞數(shù)量較少，層次減少，排列紊亂，形成不規(guī)則的空隙。
　　 (3)小鼠睪丸氧化應(yīng)激
　　 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定結(jié)果，劑量效應(yīng):隨著染毒劑量增加，納米氧化鋁(13 nm)組、納米氧化鋁(50 nm)組和微米氧化鋁(10μm)組各劑量組的GSH-PX與空白對(duì)

25、照組有減少趨勢，高劑量組減少明顯，不同粒徑組的中、高劑量組與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。粒徑效應(yīng):不同粒徑組組間GSH-PX差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 超氧化物歧化酶(SOD)測定結(jié)果，劑量效應(yīng):隨著染毒劑量增加，納米氧化鋁(13 nm)組、納米氧化鋁(50nm)組和微米氧化鋁(10μm)組各劑量組的SOD與空白對(duì)照組有減少趨勢，高劑量組減少明顯，納米氧化鋁(13 nm)組和微米氧化

26、鋁(10μm)組的高劑量組與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。納米氧化鋁(50nm)組中、高劑量組與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。粒徑效應(yīng):不同粒徑組組間GSH-PX差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 丙二醛(MDA)測定結(jié)果，劑量效應(yīng);隨著染毒劑量增加，納米氧化鋁(13n m)組、納米氧化鋁(50 nm)組和微米氧化鋁(10μm)組各劑量組的MDA與空白對(duì)照組有增加趨勢，高劑量組增加明顯，納米氧

27、化鋁(13 nm)組、納米氧化鋁(50nm)組和微米氧化鋁(10μm)組的高劑量組與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。粒徑效應(yīng):微米氧化鋁(10μm)組與納米氧化鋁(13nm)組和納米氧化鋁(50 nm)組組間MDA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 總抗氧化能力(T-AOC)測定結(jié)果，劑量效應(yīng):隨著染毒劑量增加，納米氧化鋁(13 nm)組、納米氧化鋁(50 nm)組和微米氧化鋁(10μm)組各劑量組的T-AOC

28、與空白對(duì)照組有減少趨勢，高劑量組減少明顯，不同粒徑組的高劑量組與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。粒徑效應(yīng):不同粒徑組組間T-AOC差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、納米氧化鋁(13nm和50 nm)未見致突變性，未能引起細(xì)菌氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　 2、納米氧化鋁(13nm和50nm)可以進(jìn)入細(xì)胞，并引起DNA損害，且存在時(shí)間、劑量及粒徑效應(yīng)關(guān)系，但與陽性對(duì)照組比，納米氧化鋁引

29、起DNA損害程度很弱。能引起細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，推測氧化應(yīng)激反應(yīng)是DNA損害原因之一。
　　 3、納米氧化鋁(13nm和50nm)引起小鼠骨髓微核率在正常范圍，小鼠骨髓微核試驗(yàn)陰性。
　　 4、納米氧化鋁(13nm和50nm)能引起小鼠睪丸結(jié)構(gòu)損害，引起精子畸形率升高，但與陽性對(duì)照組比，納米氧化鋁引起小鼠精子畸形率很低。能引起睪丸組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，有劑量、粒徑效應(yīng)關(guān)系。推測不同粒徑納米氧化鋁引起小鼠精子畸形試驗(yàn)陽性及睪丸病

30、理損傷與睪丸組織氧化應(yīng)激有關(guān)。
　　 5、根據(jù)以上提示納米氧化鋁(13nm和50nm)可能引起遺傳毒性，推測氧化應(yīng)激反應(yīng)參與這一過程。
　　 6、本課題局限和不足之處:(1)方法上的局限，盡管本課題選用標(biāo)準(zhǔn)的毒理學(xué)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，但納米顆粒作為新興的化合物，是否需要新的或完善的針對(duì)性的試驗(yàn)方法可以進(jìn)一步驗(yàn)證，(2)納米氧化鋁本身的小尺度效應(yīng)、表面與界面等效應(yīng)，其物理、化學(xué)性質(zhì)還不清楚，(3)如何將該試驗(yàn)組合的試驗(yàn)結(jié)果外推至人體