健脾止遺片有效成分的分離、分析及其對(duì)家兔膀胱明膠酶作用的研究.pdf

1、本文的目的是研究健脾止遺片的有效成分，分離純化得到有生物活性的、純度較高的組分，分析其理化性質(zhì)、探討活性組分對(duì)動(dòng)物膀胱明膠酶活性的影響。明確健脾止遺片有效成分的組成，為改進(jìn)該藥生產(chǎn)工藝、減少服用劑量提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床應(yīng)用研究及尿失禁的發(fā)病機(jī)理研究提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。 健脾止遺片是國家批準(zhǔn)的用于治療小兒遺尿癥的中成藥，主要成分是雞腸和雞內(nèi)金，經(jīng)動(dòng)物急性毒性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)無任何毒性及不良反應(yīng)。臨床已應(yīng)用十幾年，取得了良好

2、的效果。該藥雖批準(zhǔn)用于小兒遺尿癥，但近些年，不少中老年尿失禁患者使用，也取得滿意效果。由健脾止遺片的基礎(chǔ)研究得知，顯示生物活性的組分主要來自雞腸提取物，雞腸用于治療尿失禁，我國許多古代中醫(yī)藥書籍如《本經(jīng)》、《別錄》、《本草綱目》等都有記載，但有效成分是什么?一直未見詳細(xì)報(bào)道。 本課題參照健脾止遺片的生產(chǎn)工藝，以新鮮雞腸為原料，經(jīng)水提取制得提取物，該提取物分別在一定條件下用甲醇和水進(jìn)一步提取，得到甲醇提取物和水提取物。甲醇提取物依

3、次用Sephadex G-10及CM Sephadex C-25柱層析分離純化，水提取物依次用CM Sephadex C-25及Sephadex G-25柱層析分離純化，采用生物活性檢測(cè)的方法跟蹤分離純化過程，對(duì)所得活性組分通過紫外檢測(cè)、薄層、電泳、質(zhì)譜、氨基酸分析等技術(shù)進(jìn)行了理化性質(zhì)測(cè)定。關(guān)于尿失禁的發(fā)病機(jī)理，不少文獻(xiàn)報(bào)道組織彈性缺失，失去控尿能力，是導(dǎo)致老年尿失禁的一個(gè)主要原因。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，明膠酶可降解一些膠原蛋白、彈性蛋白等，膀

4、胱組織彈性功能的改變是否與明膠酶有關(guān)?健脾止遺片有效成分對(duì)明膠酶是否有影響等都是值得探討的問題。因此本課題分別從3周齡和60周齡家兔膀胱中提取了明膠酶，并用明膠酶譜法比較了兩個(gè)年齡組家兔膀胱中明膠酶的活性，研究了經(jīng)分離純化所得有效成分對(duì)明膠酶的影響。 結(jié)果甲醇提取物經(jīng)Sephadex G-10柱層析分離，得到七個(gè)洗脫峰，經(jīng)活性檢驗(yàn)第二個(gè)峰(SⅡ)活性最強(qiáng)，同時(shí)還檢測(cè)到第六峰(SⅥ)的作用相反。理化性質(zhì)測(cè)定表明SⅡ不含有核苷或堿基

5、，而SⅥ不含有糖類、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸及核酸，可能是核苷堿基類物質(zhì)。將S Ⅱ上CM Sephadex C-25柱，分得四個(gè)洗脫峰，經(jīng)活性檢驗(yàn)，第三峰(S Ⅱ-3)及第四峰(S Ⅱ-4)活性較強(qiáng)。通過紫外掃描、試劑檢驗(yàn)證明這兩個(gè)峰都不含有糖類、核酸或寡核苷酸、蛋白質(zhì)及多肽等物質(zhì)，但它們都能與茚三酮顯色，經(jīng)氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)得結(jié)果顯示，賴氨酸含量較高，S Ⅱ-3含14種氨基酸，賴氨酸含量高達(dá)47.45％，賴氨酸及其它堿性氨基酸約占66.1

6、8％；S Ⅱ-4含有11種氨基酸，其中賴氨酸含量為25.64％，賴氨酸及其它堿性氨基酸占30.36％。 水提取物經(jīng)CM Sephadex C-25柱層析分離得到兩個(gè)活性組分，分別為PS I及PSⅡ，將PS Ⅰ上Sephadex G-25柱層析又得到一個(gè)活性組分為PS I-1。以上三個(gè)組分與雙縮脲試劑作用都呈陽性。經(jīng)SDS-PAGE電泳的結(jié)果顯示，PS Ⅱ的分子量大于20kDa，呈連續(xù)分布，PS I-1有兩條譜帶，一條較寬，分子量6

7、6kDa左右，另一條較窄，分子量22kDa左右。 兔膀胱明膠酶活性的研究結(jié)果顯示，不同年齡家兔膀胱組織中明膠酶的活性不同，老齡兔比幼齡兔的活性強(qiáng)。本文分離所得有生物活性的組分對(duì)老齡及幼齡兔膀胱組織中明膠酶的活性均有明顯的抑制作用。 總之，研究初步建立了分離、純化有效成分的技術(shù)路線，獲得一定純度的活性成分，建立了分析檢測(cè)有效成分的方法，明確了健脾止遺片中顯示生物活性的成分，初步了解到一部分為分子量較大的可溶于水的蛋白質(zhì)

8、及多肽類物質(zhì)。另一部分是既溶于水也溶于醇的一些小分子物質(zhì)，經(jīng)檢驗(yàn)這部分主要是些氨基酸，其中以賴氨酸為主的堿性氨基酸含量較高。研究結(jié)果表明它們?cè)谏頎顟B(tài)下可能相互協(xié)調(diào)而發(fā)揮作用，并對(duì)膀胱器官有較好的靶向性，而且對(duì)膀胱括約肌和逼尿肌起到雙向調(diào)節(jié)作用，這是目前西藥無法達(dá)到的效果。 研究發(fā)現(xiàn)老齡兔膀胱中明膠酶的活性比幼齡兔高。本文分離所得有生物活性的成分對(duì)兔膀胱中明膠酶有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。這一研究方法和結(jié)果為臨床進(jìn)