脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3在神經(jīng)病理性痛中的作用.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3的表達(dá)
　　 目的：評(píng)價(jià)脊神經(jīng)結(jié)扎疼痛模型大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3的表達(dá)以及在慢性神經(jīng)病理性痛中的作用。
　　 方法：雄性SD大鼠66只，體重180～250g，隨機(jī)分為兩組：SHAM組(假手術(shù)組，n=30)，分離右側(cè)L5 脊神經(jīng)但不結(jié)扎。SNL組（n=36），結(jié)扎右側(cè)L5 脊神經(jīng)。每組大鼠均于術(shù)前1d、術(shù)后1、3、5、7、10、14、2

2、1、28d 行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)；SNL組于結(jié)扎后7d 隨機(jī)取6只大鼠利用雙重免疫熒光標(biāo)記法觀察脊髓背角GFAP和TLR3的表達(dá)；每組于術(shù)后3、7、14、21、28d 各隨機(jī)取6只大鼠斷頭處死，取L4-5 脊髓節(jié)段采用RT-PCR法測(cè)定TLR3 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：與SHAM組比較，SNL組PWPT和PWL降低（P<0.05）；SNL組大鼠術(shù)后7d 脊髓背角（術(shù)側(cè)）GFAP 陽性表達(dá)的細(xì)胞，TLR3 也呈陽性表達(dá)。與基礎(chǔ)值比較

3、，SNL組脊髓背角TLR3 mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。
　　 結(jié)論：脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3表達(dá)上調(diào)可能參與了脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠慢性神經(jīng)病理性痛的發(fā)生與發(fā)展。
　　 第二部分：脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3 在大鼠神經(jīng)病理性痛中的作用
　　 實(shí)驗(yàn)一、鞘內(nèi)注射聚肌苷-多聚胞嘧啶核甘酸(poly(I:C))誘發(fā)神經(jīng)病理性痛的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：評(píng)價(jià)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3 在大鼠神經(jīng)病理性痛中的作用。

4、r>　　 方法：雄性SD大鼠，體重180～250g，126只鞘內(nèi)置管成功的大鼠，隨機(jī)分為3組，正常對(duì)照組（C組，n=42）；生理鹽水組（NS組，n=42）鞘內(nèi)注射NS 0.5 ml/kg，1 次/d，連續(xù)7 d；神經(jīng)病理性痛組（NP組，n=42）腹腔注射米諾環(huán)素 40 mg/kg+鞘內(nèi)注射poly（I:C）0.5 mg/kg，1 次/d，連續(xù)7 d。各組大鼠于鞘內(nèi)給藥前1 d和鞘內(nèi)給藥后1、3、5、7、10、14、21、28 d 測(cè)定

5、機(jī)械痛閾和熱痛閾；各組于鞘內(nèi)給藥后7 d 各取6只大鼠，取L4-5 脊髓節(jié)段，采用免疫組化法測(cè)定脊髓背角膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)；各組于鞘內(nèi)給藥前1 d和后1、7、14、21、28 d各取處死6只大鼠，取L4-5 脊髓節(jié)段，采用RT-PCR法測(cè)定TLR3 mRNA的表達(dá)變化趨勢(shì)，以及術(shù)后7 d IL-6、TNF-a、IFN-β和IP-10 mRNA的表達(dá)，并使用ELISA法測(cè)定IL-6和IP-10 蛋白變化。
　　 結(jié)

6、果：與C組和NS組比較，NP組PWPT降低并持續(xù)至術(shù)后28天（P<0.05）；NP組脊髓背角GFAP免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物表達(dá)相對(duì)面積分別增加93.1%（P<0.01）和90.9%（P<0.01）；與基礎(chǔ)值比較，NP組脊髓背角TLR3 mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。與NS組比較，NP組鞘內(nèi)注射poly(I:C)后7 d天脊髓IL-6、TNF-a、IFN-β和IP-10 mRNA表達(dá)均上調(diào)（P<0.05），脊髓IL-6（9.5ng/g）和I

7、P-10（12.3ng/g）蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）。
　　 結(jié)論：脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3可能參與了大鼠神經(jīng)病理性痛的形成與維持。
　　 實(shí)驗(yàn)二、鞘內(nèi)注射TLR3反義寡聚核苷酸對(duì)脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠的鎮(zhèn)痛作用
　　 目的：探討脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3 在神經(jīng)病理性疼痛中的作用。
　　 方法：雄性SD大鼠，體重180～250 g。實(shí)驗(yàn)Ⅰ 108只鞘內(nèi)置管大鼠隨機(jī)分為：生理鹽水（NS）20μl+脊神經(jīng)

8、結(jié)扎（SNL）（A組，n=36），錯(cuò)義寡聚核苷酸（MM-ODN）20μg/d+SNL（B組，n=36），反義寡聚核苷酸（AS-ODN）20μg/d+SNL（C組，n=36）。實(shí)驗(yàn)Ⅱ 108只SNL后7d 大鼠隨機(jī)分為：SNL+NS 20μl（D組，n=36），SNL+MM-ODN 20μg/d（E組，n=36），SNL+AS-ODN 20μg/d（F組，n=36）。
　　 實(shí)驗(yàn)Ⅰ和實(shí)驗(yàn)Ⅱ分別于SNL 前1d和后7d開始鞘注，每天

9、一次，共7d；于術(shù)后-1、1、3、5、7、10、14d和-1、7、10、12、14 d 行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)Ⅰ和實(shí)驗(yàn)Ⅱ分別于術(shù)后7d和14d 每組各隨機(jī)取6只大鼠利用免疫組織化學(xué)法觀察脊髓背角GFAP的表達(dá)，并于術(shù)后-1、3、7、14d和術(shù)后-1、7、10、14d 每組各隨機(jī)取6只大鼠斷頭處死，取L4-5 脊髓節(jié)段采用RT-PCR法測(cè)定TLR3和IL-6 mRNA的表達(dá)，以及于術(shù)后7 d和術(shù)后14 d 使用ELISA法測(cè)定IL-6和IP-

10、10 蛋白變化。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)Ⅰ與A組比較，C組PWPT 升高并持續(xù)至術(shù)后14d（P<0.05），C組各時(shí)點(diǎn)PWL 無明顯變化（P>0.05）；與A組和B組比較，C組脊髓背角GFAP免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物表達(dá)相對(duì)面積分別下降46.4%（P<0.01）和45.7%（P<0.01）；與A組和B組比較，C組鞘內(nèi)注射AS-ODN 抑制了TLR3和IL-6 mRNA 以及IL-6和IP-10 蛋白的表達(dá)（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)Ⅱ D組、E組和

11、F組在PWPT、PWL、GFAP表達(dá)、TLR3和IL-6 mRNA 以及IL-6和IP-10 蛋白表達(dá)方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3可能參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與發(fā)展。
　　 第三部分：脊髓背角JNk活化在TLR3介導(dǎo)的神經(jīng)病理性痛中的作用
　　 目的：觀察大鼠鞘內(nèi)注射poly(I:C)及TLR3 反義寡聚核苷酸后脊髓背角c-Jun 氨基末端激酶（JNK）活化

12、水平的變化，探討JNk在TLR3介導(dǎo)的神經(jīng)病理性痛中作用。
　　 方法：雄性SD大鼠24只，體重180～250g，隨機(jī)分為4組：A組（n=6），鞘內(nèi)注射poly(I:C)0.5mg/kg；B組（n=6），鞘內(nèi)注射SP600125 50nmol+poly(I:C)0.5mg/kg，A和B組每天鞘內(nèi)注射一次，共7 d；C組（n=6），鞘內(nèi)注射MM-ODN20μg/d+脊神經(jīng)結(jié)扎（SNL）；D組（n=6），鞘內(nèi)注射AS-ODN 20μ

13、g/d+SNL，C和D組于SNL 前一天開始鞘內(nèi)注射，每天一次，共7 d。A、B組和C、D組分別于鞘內(nèi)注射和SNL后-1、1、3、5、7d 行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，并分別于鞘內(nèi)注射和SNL后7d 每組取6只大鼠利用免疫熒光組織化學(xué)法觀察脊髓背角pJNK的表達(dá)。
　　 結(jié)果：與A組比較，B組PWPT 下降被SP600125 阻止（P<0.05），PWL 無明顯變化（P>0.05）；與C組比較，D組AS-ODN 阻止了PWPT 下降（P<0.