高同型半胱氨酸致動(dòng)脈粥樣硬化的氧化應(yīng)激機(jī)制及Lutein的干預(yù)作用研究.pdf

1、研究背景:
　　隨著人們生活水平的不斷提高和疾病譜的變化，慢性非傳染性疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命和健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，其中在世界范圍內(nèi),心腦血管疾病具有較高的發(fā)病率與病死率,已位于死因順位的前列。而動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis, AS）是多種心、腦血管病發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。
　　關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的病因?qū)W和發(fā)病學(xué)存在諸多觀點(diǎn)。近年來(lái)大量流行病學(xué)研究證實(shí),高同型半胱氨酸血癥( Hyperhomocyst

2、einemia, HHcy)作為AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中一個(gè)新的、重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素越來(lái)越受到廣大學(xué)者的廣泛重視,但其介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的確切的生物化學(xué)和分子機(jī)制尚未充分闡明，因而尚缺乏對(duì)AS及心腦血管疾病行之有效的干預(yù)防治手段。因此，深入探討動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的病因?qū)W和發(fā)病學(xué)，從生物化學(xué)和分子生物學(xué)水平揭示動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上尋求行之有效的干預(yù)防治途徑和線索具有重要的理論和實(shí)用意義。
　　葉黃素（Lutein）是

3、一種天然植物化學(xué)物。分子式：C40H56O2，分子量：568.85。結(jié)構(gòu)上屬于含氧類(lèi)胡蘿卜素。與其他含羥基類(lèi)胡蘿卜素相比，葉黃素分子的兩邊分別含一個(gè)β-紫羅酮環(huán)和一個(gè)ε-紫羅酮環(huán)以及多個(gè)共軛不飽和雙鍵，這種特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予其很強(qiáng)的抗氧化活性和多種生物學(xué)功能。大量流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，葉黃素在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有保護(hù)作用，但其確切的生化和分子機(jī)制尚不明晰。尤其是葉黃素對(duì)高同型半胱氨酸致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的干預(yù)阻斷的效應(yīng)及

4、機(jī)制研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)諸報(bào)道，成為本研究的切入點(diǎn)所在。
　　目的:
　　1.揭示冠心病患者血液同型半胱氨酸水平與氧化應(yīng)激狀態(tài)的相關(guān)關(guān)系。
　　2.從生物化學(xué)和分子生物學(xué)層面探討實(shí)驗(yàn)性高同型半胱氨酸血癥大鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激（oxidative stress）狀態(tài)，反應(yīng)血管內(nèi)皮功能的一氧化氮（nitric oxide， NO）和內(nèi)皮素-1（endothelin-1, ET-1)水平的改變以及一些炎癥相關(guān)信息分子包括核轉(zhuǎn)錄因子κB

5、（nuclear factor-kappa B, NF-κB）以及細(xì)胞間黏附分子-1(interce llular adhesion molecule-1，ICAM-1)基因表達(dá)改變，并采用業(yè)已證實(shí)具有抗氧化作用的植物化學(xué)物葉黃素（Lutein）進(jìn)行干預(yù)處理，進(jìn)一步揭示和佐證HHcy介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的可能分子機(jī)制。最終期望能獲取基于該分子機(jī)制的行之有效的干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的新線索和新途徑。
　　方法:
　　1.對(duì)冠

6、心病患者實(shí)施血清同型半胱氨酸（Hcy)水平，以及反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathine peroxidease,GPx）和過(guò)氧化氫酶（catalase, CAT）的活力以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測(cè)定。揭示冠心病患者的血漿Hcy水平，機(jī)體的氧化/抗氧化平衡狀態(tài)以及冠心病機(jī)體Hcy水平與氧化應(yīng)激狀態(tài)的相關(guān)

7、關(guān)系。
　　2.構(gòu)建高同型半胱氨酸血癥Wistar大鼠模型。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組，模型組，葉酸組干預(yù)組及葉黃素（Lutein）干預(yù)組?？瞻讓?duì)照組(10只):1％羧甲基纖維素鈉( CMC)液2 ml灌胃,每日1次,然后給予正常飼料,共8周。模型組(10只):3%蛋氨酸混懸液(1.5g/kg體質(zhì)量)灌胃,每日1次,然后給予正常飼料,共8周。葉酸干預(yù)處理組(10只):3%蛋氨酸混懸液,加葉酸混懸液(60mg/Kg體質(zhì)量)灌

8、胃,每日1次,然后給予正常飼料,共8周。葉黃素干預(yù)處理組(10只):3%蛋氨酸混懸液,加葉黃素混懸液(20mg/kg體質(zhì)量)灌胃,每日1次,然后給予正常飼料,共8周。
　　3．各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)至8周末,腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛麻醉,心臟取血，離心分離血清。標(biāo)本于-80℃冰箱保存。測(cè)定各組動(dòng)物血清Hcy濃度及其它指標(biāo)包括血清SOD、GPx、CAT活性，血清MDA含量及羥自由基(OH·)水平，血清總抗氧化能力（T-AOC）,血清

9、NO及ET-1的含量。
　　4．采取各組大鼠部分主動(dòng)脈血管壁組織，用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)主動(dòng)脈血管壁組織SOD2、GPx1、NF-κBp65以及ICAM-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.研究結(jié)果顯示，冠心病患者血漿清Hcy顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)血清Hcy升高是冠心病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果亦顯示，冠心病患者M(jìn)DA含量顯著高于正常組，而起重要抗氧化防御作用的S

10、OD、GPx的活力則較對(duì)照組顯著性降低。揭示冠心病的發(fā)生涉及自由基代謝的紊亂和氧化/抗氧化狀態(tài)的失衡，表現(xiàn)為氧化應(yīng)激的亢奮狀態(tài)。本研究結(jié)果還顯示，冠心病患者血清Hcy含量與反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的MDA含量進(jìn)行相關(guān)分析表明，兩者存在正相關(guān)關(guān)系。綜合研究結(jié)果顯示,冠心病患者機(jī)體氧化應(yīng)激的亢奮狀態(tài)，可能是血清高Hcy介導(dǎo)動(dòng)脈硬化發(fā)生的機(jī)制之一。
　　2.成功復(fù)制了大鼠 HHcy動(dòng)物模型，探討了其介導(dǎo)動(dòng)脈硬化發(fā)生的氧化應(yīng)激分子機(jī)制，并在此

11、基礎(chǔ)上采用業(yè)已證實(shí)具有很強(qiáng)抗氧化作用的天然植物化學(xué)物葉黃素（Lutein）進(jìn)行干預(yù)處理。
　　3.結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比,HHcy模型大鼠血清 SOD及 GPx活性顯著降低， MDA含量及羥自由基水平則顯著升高，總抗氧化能力 T-AOC顯著下降。表明 HHcy模型大鼠機(jī)體亦處于氧化應(yīng)激的增強(qiáng)狀態(tài)。而 Lutein干預(yù)組大鼠血清SOD及GPx活性則顯著升高，MDA含量及羥自由基水平顯著下降，總抗氧化能力T-AOC顯著增加，揭示Lut

12、ein可抵御HHcy模型大鼠誘發(fā)的氧化應(yīng)力亢奮。
　　4.結(jié)果還顯示,模型組大鼠血漿NO水平顯著降低，ET-1水平顯著升高，表明HHcy可籍此介導(dǎo)血管內(nèi)皮功能的障礙。而Lutein干預(yù)組大鼠血清NO水平顯著升高，ET-1水平顯著下降。提示Lutein可逆轉(zhuǎn)HHcy誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙。
　　5.用RT-PCR及Western Blot檢測(cè)結(jié)果亦顯示，HHcy模型大鼠主動(dòng)脈血管壁組織中反映氧化應(yīng)激水平的抗氧化酶SOD2及GP

13、x1的mRNA及蛋白表達(dá)降低，炎性相關(guān)信息分子NF-κBP65及細(xì)胞粘附因子ICAM-1的表達(dá)增強(qiáng)。而Lutein干預(yù)組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮 SOD2及 GPx1的 mRNA水平及蛋白表達(dá)上調(diào)， NF-κBP65及ICAM-1的表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.冠心病患者血清 Hcy水平顯著高于正常人，且機(jī)體處于氧化應(yīng)激的亢分狀態(tài)。相關(guān)分析表明，冠心病患者血漿Hcy水平與機(jī)體氧化應(yīng)激的加強(qiáng)存在相關(guān)關(guān)系。結(jié)果佐證了血漿Hcy水平升高是

14、冠心病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因子之一，并且可能通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制介導(dǎo)。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HHcy模型大鼠機(jī)體亦存在氧化應(yīng)激狀態(tài)的加強(qiáng)，表現(xiàn)為抗氧化酶SOD、GPx活性的降低，脂質(zhì)過(guò)氧化水平增強(qiáng)。同時(shí)模型組大鼠血漿NO水平降低， ET-1水平升高，表明HHcy介導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙。用RT-PCR及Western Blot檢測(cè)結(jié)果亦顯示，HHcy模型大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮中反映氧化應(yīng)激水平的抗氧化酶SOD2及GPx1的mRNA水平及蛋白表達(dá)降

15、低，而炎性相關(guān)信息分子NF-κB P65及細(xì)胞粘附因子ICAM-1的表達(dá)增強(qiáng)。
　　3.首次采用Lutein對(duì)HHcy模型大鼠的干預(yù)研究結(jié)果顯示，Lutein雖然沒(méi)有顯著降低血清Hcy的作用，但可顯著干預(yù)和改變Hcy所介導(dǎo)的生物化學(xué)行為變化。表現(xiàn)為可上調(diào)抗氧化酶SOD2和GPx1的表達(dá)，提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，同時(shí)下調(diào)NF-κBP65及ICAM-1的基因表達(dá)。結(jié)果提示，Lutein對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化早期的干預(yù)保護(hù)作用，可能源于 Lu

16、tein作為抗氧化劑的直接作用，而非通過(guò)降低血清同型半胱氨酸水平而發(fā)揮的間接作用。
　　4.綜合研究結(jié)果顯示:HHcy是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。氧化應(yīng)激和炎癥是其介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要分子機(jī)制。尤其是HHcy誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激加劇，可能是HHcy介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)機(jī)制，進(jìn)一步引發(fā)NF-κB及其包括ICAM-1在內(nèi)的下游炎癥因子的表達(dá)，從而關(guān)聯(lián)動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。Lutein可顯著干預(yù)抑制Hcy所介導(dǎo)的氧化