AIP1調控血管增生的分子機制及對小鼠視網膜血管發(fā)生的影響.pdf

1、AIP1(ASK1相互作用蛋白-1)或稱DAB2相互作用蛋白，是近來鑒定的Ras—GTP酶活化蛋白家族新成員，參與細胞生長抑制和細胞凋亡。然而，AIP1體內的功能研究并不清楚。本實驗采用血管研究常用的動物模型觀察AIP1對血管增生調控的表型，并探討其內部的分子機制；進而，以視網膜血管發(fā)生模型研究AIP1對血管生成的影響。 第一部分AIP1作為內源性抑制因子調控VEGFR2信號介導的血管增生 目的：研究AIP1基因在體內對

2、血管增生的調控功能及其分子機制。 方法：以AIP1基因敲除鼠(AIP1-KO)為研究對象，采用不同的實驗動物模型包括小鼠后肢缺血模型及VEGF誘導的耳廓皮膚，角膜和視網膜新生血管模型觀察血管增生的表型；進而，過表達AIP1研究血管表型的改變。同時，通過VEGF依賴的血管增生體外模型包括血管內皮細胞遷移和血管樣結構形成實驗，研究AIP1對血管內皮細胞功能的影響。此外，在分子機制研究方面，不同時間點內皮細胞VEGF處理，Wester

3、nblot檢測AIP1敲除對VEGFR2信號通路(VEGFR2、PLC—γ和Akt磷酸化)的影響。免疫共沉淀分析AIP1是否直接結合于VEGFR2受體形成復合體而抑制VEGFR2信號。為研究AIP1跟VEGFR2結合的結構域，載體編碼表達的全長AIP1(AIP1-F)，AIP1-N或AIP1-C與VEGFR2共表達，AIP1-VEGFR2的結合通過免疫共沉淀分析。VEGFR2與不同AIP1突變體(N，PR，PHC2)質粒共轉染無內源性V

4、EGFR2表達的293T細胞，檢測不同的AIP1突變體對VEGFR2依賴的信號通路的抑制。 結果：縱觀各種血管增生模型，一致的表型是AIP1-KO鼠表現出顯著的血管增生，伴隨異常增強的VEGF—VEGFR2信號。視網膜VEGF誘導的血管增生可以被過表達AIP1所抑制，一致的是，體外實驗中內皮細胞過表達AIP1可以抑制(但敲除或沉默AIP1后增強)VEGF誘導的VEGFR2信號和內皮細胞遷移。分子機制研究表明，在VEGF反應的后期

5、，AIP1被募集到VEGFR2-PI3K復合體，導致VEGFR2依賴的信號通路抑制。AIP1的C2結構域對VEGFR2結合極為重要。AIP1通過不同結構域，作用于VEGFR2和PI3Kp85，導致VEGFR2依賴的血管增生信號抑制。 結論：AIP1作為內源性抑制因子直接與VEGFR2結合并抑制VEGFR2介導的血管增生。 第二部分AIP1基因對小鼠視網膜血管發(fā)生的影響 目的：研究AIP1對小鼠視網膜血管發(fā)生的影響

6、，并探討相關的分子調控機制。 方法：觀察新生AIP1-WT、AIP1-KO小鼠視網膜(代表了生理性的血管增生)以及氧誘導的視網膜血管病變(OIR)小鼠模型(代表了病理性血管增生)血管形態(tài)，研究AIP1對視網膜衄管發(fā)生的影響；進而以小鼠視網膜內皮細胞為工具研究相應的信號調控途徑。 結果：在出生后早期AIP1-KO小鼠視網膜血管發(fā)育明顯慢于AIP1-WT鼠。GFAP及VE-cadherin的表達也相應減弱。WesternBl

7、ot檢測VEGFR2-Dll4-Notch1cleaved呈大致同向變化，即P4、P5逐漸增加，VEGFR2在P5達到峰值，但在P7Dll4表達升至峰值時VEGFR2的表達卻明顯下降，我們驗證了高表達至一定程度的Dll4對VEGFR2有負向調控作用。進而，mRNA表達檢測發(fā)現AIP1-KO鼠視網膜Notch1及其下游分子Hey1明顯增加，但另一與血管增生及成熟關系密切的細胞因子PDGFBB受體PDGFRβ無顯著的表達差異。因為Dll4活

8、化可以引起血管出芽減少，血管生長緩慢，我們證實AIP1通過Notch-Dll4依賴的信號通路調控早期視網膜的血管發(fā)育。此外，從小鼠OIR模型可見，P17AIP1-KO鼠視網膜可見顯著的血管出芽和分枝形成。WesternBlot分析AIP1-KO鼠視網膜的VEGFR2表達高于AIP1-WT鼠，這種高表達可以被高氧抑制。相對低氧情況下，視網膜VEGFR2重新被誘導，恢復高表達狀態(tài)，在AIP1-KO鼠的增加更為顯著。但是，作為血管增生的內源性

9、抑制因子PEDF無論高氧還是相對低氧，AIP1-KO鼠的表達都高于AIP1-WT；低氧時，AIP-KO鼠PEDF的表達比常氧狀態(tài)增加。說明PEDF不但拮抗低氧誘導的血管增生，而且參與拮抗AIP1依賴的VEGFR2介導的血管增生。P17時Dll4表達輕微增加但血管出芽和發(fā)生沒有顯著抑制，說明Notch信號在病理性血管增生并沒有起主要的調控作用。 分子機制研究，AIP1-WT鼠視網膜微血管內皮細胞(MREC)VEGF處理30分鐘時，

10、Dll4表達第一次達到高峰，但隨后逐漸下降，2h重新表達顯著增強；Notch1的被動活化形態(tài)與Dll4完全一致。但在Dll4表達高峰時(30min、2h)，VEGFR2的表達相應減弱，說明VEGF誘導的Dll4高表達存在對VEGFR2的負向調控。值得注意的是，AIP1的表達在此時也顯著增強。我們推測AIP1可能協同Dll4，共同抑制了VEGFR2活化。而在AIP1-KOMRECVEGF處理后，Dll4立即達到峰值，隨后下降，在1h后重新