Kringle1-5抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 建立高氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管動(dòng)物模型，觀(guān)察動(dòng)物模型視網(wǎng)膜新生血管的形成、發(fā)展及消退情況；在此基礎(chǔ)上，觀(guān)察不同濃度的Kringle 1-5對(duì)小鼠視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用及在新生血管形成不同時(shí)期應(yīng)用時(shí)作用的差別，并檢測(cè)用藥后小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況，以探討Kringle 1-5抑制視網(wǎng)膜新生血管的作用機(jī)制。 材料和方法 一、高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管動(dòng)物模型的建立與觀(guān)察1．動(dòng)物模型的建立健康C57B

2、L/6J新生小鼠24只，性別不限，隨機(jī)分為高氧模型組與正常對(duì)照組，每組12只(24眼)。高氧模型組小鼠于生后7天與同籠的一只母鼠一起進(jìn)入塑料制作的密閉氧箱，另選生育有同齡幼鼠的母鼠生活在正常大氣環(huán)境中做替換母鼠。氧箱內(nèi)通入85％的濕潤(rùn)氧氣，每日檢測(cè)氧濃度3～4次，維持氧箱內(nèi)氧氣的體積分?jǐn)?shù)為(75±2)％。每天一次打開(kāi)氧箱加食、換水、替換母鼠，5天后將小鼠返回正常大氣環(huán)境中。正常對(duì)照組小鼠普通大氣環(huán)境中飼養(yǎng)。所有小鼠均于自然光照明下飼養(yǎng)，

3、溫度控制在23℃±2℃。 2．視網(wǎng)膜新生血管的觀(guān)察于小鼠生后15、17、19、21、24、30天時(shí)，分別取高氧模型組和正常對(duì)照組各2只小鼠(4眼)，麻醉后經(jīng)上腔靜脈注射2％伊文思藍(lán)(Evans blue)溶液，待循環(huán)5分鐘后處死小鼠，摘取眼球，置4％多聚甲醛固定。固定3小時(shí)后分離視網(wǎng)膜并鋪片，熒光顯微鏡下觀(guān)察視網(wǎng)膜血管情況。 二、Kringle 1-5抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究1．不同濃瘦的Kringle 1-5對(duì)

4、視網(wǎng)膜新生血管形成的影響健康C57BL/6J新生小鼠60只，性別不限，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高氧對(duì)照組、0.1μg治療組、0.5μg治療組、2.5μg治療組和5μg治療組，每組10只。正常對(duì)照組新生小鼠正常大氣環(huán)境飼養(yǎng)；高氧對(duì)照組及各治療組小鼠制作視網(wǎng)膜新生血管動(dòng)物模型。高氧對(duì)照組于小鼠生后12天時(shí)右眼玻璃體腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS)1μg，0.1μg治療組、0.5μg治療組、2.5μg治療組和5μg治療組分別于小鼠生后12天時(shí)右眼玻璃

5、體腔內(nèi)注射濃度為0.1μg/μl、0.5μg/μl、2.5μg/μl和5μg/μl的Kringle 1-5蛋白溶液1μl。于術(shù)后5天(即出生后17天)觀(guān)察小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成情況，觀(guān)察項(xiàng)目有： (1) 伊文思藍(lán)視網(wǎng)膜血管造影(每組4眼)：2％伊文思藍(lán)小鼠上腔靜脈注射，處死后取眼球固定，分離視網(wǎng)膜進(jìn)行鋪片，熒光顯微鏡下觀(guān)察視網(wǎng)膜血管情況并照相； (2) 組織學(xué)檢查及血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)(每組6眼)：處死動(dòng)物摘取眼球，常規(guī)組織

6、固定，石蠟包埋，連續(xù)組織切片，蘇木素．伊紅(HE)染色，每隔90μm取一張切片，含視乳頭的切片棄去，光鏡下觀(guān)察計(jì)數(shù)突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核，即新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，定量分析比較。 2．在視網(wǎng)膜新生血管形成不同時(shí)期應(yīng)用Kringle 1-5根據(jù)前述研究得出的最低有效濃度，確定藥物劑量為0.1μg。取健康C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高氧對(duì)照組、P12治療組和P17治療組。正常對(duì)照組于正常大氣中飼養(yǎng)，高氧對(duì)照組及治療組制作成高氧

7、誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管動(dòng)物模型，P12治療組于生后12天時(shí)右眼玻璃體腔注射0.1，∥g似llKringle 1—5蛋白溶液1μl，P17治療組于生后17天時(shí)右眼玻璃體腔注射0.1μg/μl Kringle 1-5蛋白溶液1μl。于生后21天時(shí)觀(guān)察小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成情況，觀(guān)察項(xiàng)目同前。 3．Kringle 1-5對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況影響的檢測(cè)取健康C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高氧對(duì)照組和P17治療組，P1

8、7治療組于生后17天時(shí)右眼玻璃體腔注射0.1μg/μl Kringle 1-5蛋白溶液1μl。于生后18、19、20、21天時(shí)，取三組小鼠各一只處死，摘除眼球快速凍存，制成冰凍切片。應(yīng)用TUNEL法原位檢測(cè)凋亡的細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的免疫熒光標(biāo)志CD31雙染來(lái)識(shí)別血管內(nèi)皮細(xì)胞，凋亡細(xì)胞中有CD31顯色的即為凋亡的血管內(nèi)皮細(xì)胞。觀(guān)察比較各組中凋亡的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果一、高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管動(dòng)物模型所有高氧誘導(dǎo)模型小

9、鼠均出現(xiàn)視網(wǎng)膜新生血管生成反應(yīng)。視網(wǎng)膜鋪片伊文思藍(lán)灌注造影可以清楚、完整的顯示小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型中視網(wǎng)膜血管無(wú)灌注區(qū)、血管滲漏、新生血管形成等視網(wǎng)膜血管病變。 正常小鼠在生后15、17、21、24、30天視網(wǎng)膜血管分布均勻，無(wú)異常改變。高氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜在生后15天出現(xiàn)大量的無(wú)灌注區(qū)，伴血管迂曲擴(kuò)張、滲漏、新生血管及微動(dòng)脈瘤形成，在生后17天時(shí)新生血管生成反應(yīng)達(dá)到高峰，生后24天開(kāi)始退縮，至生后30天時(shí)基本恢復(fù)正常。

10、 二、Kringle 1-5抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究 1．不同濃度的Kringle 1-5對(duì)視網(wǎng)膜新生血管形成的影響伊文思藍(lán)灌注造影顯示0.1μg、0.5μg、2.5μg和5μg的Kringle 1-5蛋白溶液玻璃體腔注射組小鼠視網(wǎng)膜新生血管顯著減少，血管滲漏減輕，無(wú)灌注區(qū)仍然可見(jiàn)。 石蠟切片HE染色顯示，正常對(duì)照組、高氧對(duì)照組、0.1μg、0.5μg、2.5μg和5μg的Kringlel-5治療組平均每眼突破

11、內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為0.20±0.15、36.70±21.23、10.80±9.07、9.60±7.41、8.52±7.70和8.71±6.62。各治療組與高氧對(duì)照組、正常對(duì)照組之間比較，差異均具有顯著性意義(P<0.01)，各治療組之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 2．Kringle 1-5對(duì)視網(wǎng)膜新生血管形成不同階段的作用伊文思藍(lán)灌注造影顯示在生后21天時(shí)P12治療組和P17治療組視網(wǎng)膜新生血管較高氧對(duì)照組

12、明顯減少，其中以P12治療組減少更為顯著。 石蠟切片HE染色顯示，正常對(duì)照組、高氧對(duì)照組、P12治療組和P17治療組在生后21天時(shí)平均每眼突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為0.09±0.05、19.22±9．85、2.04±1.16、7.88±3.89，各組之間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 3．Kringlel-5對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況影響的檢測(cè)在高氧組和Kringle 1-5治療組均可見(jiàn)到成簇的CD3

13、1標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞，治療組與高氧對(duì)照組相比凋亡的血管內(nèi)皮細(xì)胞情況未見(jiàn)明顯差異。 結(jié)論 1．伊文思藍(lán)灌注造影可以清楚的顯示高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型視網(wǎng)膜血管形態(tài)改變。 2．高氧誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型，在生后15天時(shí)新生血管已經(jīng)開(kāi)始形成，并在生后17天時(shí)達(dá)到高峰，生后24天開(kāi)始逐漸退縮，生后30天時(shí)基本恢復(fù)正常。 3．在高氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型中，0.1μg、0.5μg、