馬鈴薯晚疫病菌RxLR效應(yīng)蛋白與寄主蛋白互作促進侵染的機制研究.pdf

1、馬鈴薯晚疫病(Potato Late Blight)由致病疫霉菌P.infestans引起，該病害在適宜的環(huán)境條件下能快速發(fā)展造成病害流行，是一種毀滅性的卵菌病害。生產(chǎn)上，防控馬鈴薯晚疫病最有效的手段是種植抗病品種，但是由于該病病原菌P.infestans不斷發(fā)生毒性變異，經(jīng)常導(dǎo)致作物品種抗性的喪失，病害呈周期性流行和爆發(fā)。
　　在晚疫病菌侵染寄主的過程中，該病原菌與寄主發(fā)生互作，植物體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這包括復(fù)雜的交叉-結(jié)合的信號傳

2、輸網(wǎng)和信號調(diào)節(jié)過程。植物誘導(dǎo)防御的第一個階段包括對保守微生物分子的認知（病原菌相關(guān)分子模式;PAMPs），或者由于細胞的損傷而產(chǎn)生的分子(DAMPs)的識別，導(dǎo)致防御通道的激活，這一過程被稱為跨膜識別受體觸發(fā)的防衛(wèi)反應(yīng)(PTI)。寄主的特異性病原物則逐步地操縱和抑制PTI，來提高植物感病性。效應(yīng)蛋白（Effector），是植物病原微生物在與寄主植物互作過程中分泌的、可被植物NBS-LRR抗性蛋白特異識別、兼具毒性與無毒性功能的蛋白，是病

3、原物用于抑制PTI的策略之一。因此，鑒定效應(yīng)蛋白及與它們互作的寄主靶蛋白，以及研究效應(yīng)蛋白操縱寄主使植物感病機制是當前研究的一個重點。
　　本論文以致病疫霉菌（Phytophthora infestans）分泌的定位在細胞核上的重要效應(yīng)蛋白PexRD41為研究對象，該效應(yīng)蛋白的基因地址是04089，因此本研究通稱PITG_04089(Pi04089)，獲得的研究結(jié)果如下:
　　(1)通過在Pi04089基因序列的N端融合綠色

4、熒光蛋白GFP，介導(dǎo)農(nóng)桿菌后轉(zhuǎn)染模式植物本氏煙，接種馬鈴薯晚疫病菌，與對照GFP空載體相比，顯著促進了馬鈴薯晚疫病的侵染。借助共聚焦熒光顯微鏡Confocal進行活體觀察，確定了PITG_04089蛋白顯著地定位于細胞核，在細胞核核仁周圍形成一個環(huán)。被測RxLR效應(yīng)蛋白PITG_04089(Pi04089)基因表達量在晚疫病菌侵染的早期階段（24h和48h）出現(xiàn)顯著的基因上調(diào)，這種上調(diào)作用甚至可以持續(xù)到72h。
　　(2)為了驗證

5、核仁在Pi04089行使功能中的作用，本研究在GFP-040894 N端加入出核信號NES，形成NESGFP-Pi04089融合蛋白，經(jīng)confocal觀察，GFP綠色熒光蛋白在細胞核仁中顯著減少，同時細胞質(zhì)中的綠色熒光顯著增強，說明該信號將GFP-Pi04089極大地運出細胞核。在本氏煙上進行ATTA實驗，瞬時表達GFP-Pi04089和NESGFP-Pi04089后接種晚疫病菌，病斑測量值進行方差實驗，結(jié)果顯示與GFP-Pi0408

6、9相比，修飾后的NESGFP-Pi04089顯著地降低了晚疫病菌的侵染水平，大大削弱了效應(yīng)蛋白Pi04089對晚疫病的侵染，表明細胞核是Pi04089在植物體內(nèi)實現(xiàn)功能的重要部位。
　　(3)為了篩選Pi04089在植物體內(nèi)的互作靶蛋白，實驗室構(gòu)建了馬鈴薯晚疫病菌酵母雙雜交庫，cDNA文庫材料來自于P.infestans侵染15h和72h的馬鈴薯植株病組織，從酵母雙雜交系統(tǒng)中篩選到Pi04089在寄主中的靶蛋白為含3個KH結(jié)構(gòu)域的

7、RNA結(jié)合蛋白KRBP1（命名為StKRBP1）。此外，通過免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)，也驗證了StKRBP1與Pi04089在植物體內(nèi)的互作關(guān)系。
　　(4)通過雙分子熒光互補(BiFC)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Pi04089與KRBP1互作發(fā)生在細胞核內(nèi)，免疫印跡western blotting實驗證實了這些蛋白組合在植物中穩(wěn)定存在。當Pi04089與KRBP1在本氏煙共表達(co-expression)時，Pi04089原先在細胞核核仁

8、的環(huán)消失，定位因KRBP1的存在而改變，該效應(yīng)蛋白定位到與KRBP1相同的細胞核核斑點上。在兩者共表達植株上接種晚疫病菌，發(fā)現(xiàn)在病原菌早期侵染階段(24h)，KRBP1蛋白表達量顯著提高，因此證明了KRBP1對晚疫病菌侵染起正調(diào)節(jié)的作用。
　　(5)利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)，將KHRBPs的保守基序GxxG突變?yōu)镚DDG，構(gòu)建了2個VIGS突變體StKRBP1 mut。通過酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)，證明該突變體與P

9、i04089在酵母和植物體內(nèi)不再互作。突變體阻止了Pi04089在核斑點上的定位，StKRBP1 mut蛋白表達量也沒有增加。
　　(6)突變體StKRBP1 mut不再幫助晚疫病菌提高對葉片的侵染，這表明核苷酸結(jié)合位點對效應(yīng)蛋白Pi04089與KRBP1互作是必要的。
　　研究結(jié)果顯示KRBP1是一個感病因子(Susceptibility Factor)，效應(yīng)蛋白Pi04089可能修飾或增強了KRBP1的活性，與KRBP協(xié)