新型流感通用疫苗研究.pdf

1、流感病毒是一種重要的傳染源?？梢砸鹆鞲斜l(fā)流行。通用流感疫苗已經(jīng)研制多年。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些保守抗原靶位，如HA2，M2和NP蛋白。血凝素C端的HA2形成莖部結(jié)構(gòu)錨定在病毒囊膜中,引起病毒囊膜與細胞膜的融合和病毒粒子核衣殼的釋放。血凝素 C端的HA2形成莖部結(jié)構(gòu)錨定在病毒囊膜中,引起病毒囊膜與細胞膜的融合和病毒粒子核衣殼的釋放。以往的研究表明，HA2是一個重要的保守性抗原，可能用于通用的研究。
　　目的：本研究旨在通過選擇流感病毒

2、保守抗原片段，獲得可對各種流感病毒具有保護作用的通用疫苗，利用優(yōu)化編碼病毒抗原密碼子策略，同時采用CD40L作為分子佐劑，獲得可顯著提高免疫效果的流感疫苗。
　　方法：本研究擬將 CD40L作為佐劑，采用病毒載體在體內(nèi)真核表達 HA2基因與CD40L基因重組表達融合蛋白的策略。CD40L序列的加入可以使融合蛋白通過CD40L與免疫效應(yīng)細胞APC和B細胞，直接激活免疫系統(tǒng)，。CD40L可與APC表面的CD40結(jié)合，從而誘導細胞毒性T

3、淋巴細胞（CTLs）的活化，釋放IFN-γ，使CTLs直接殺傷感染細胞。另一方面，CD40L與B細胞表面的CD40結(jié)合，可以使刺激B細胞活化的抗原閾值降低，誘導B細胞針對其所攜帶抗原 HA2的活化和增殖、促進 HA2特異性的免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)換、抗體合成和分泌。此外，SHAF2CD40L復合物也可誘導 DC細胞分泌一系列重要的細胞因子和趨化因子，進一步上調(diào) T細胞表面CD40L的表達。
　　本研究首先通過 PCR拼接及酶切連接的方法

4、重組出 HA2、SHA2、SHA2FCD40L、SFCD40L、HA2FCD40L、SFCD40L及S2HA2FCD40L共6個基因重組片段，其中 S2HA2FCD40L為優(yōu)化密碼子的重組質(zhì)粒。將這6個重組基因通過穿梭質(zhì)粒插入腺病毒載體。
　　選取 SHA2、SHA2FCD40L、S2HA2FCD40L及空載體對照組進行動物實驗。對于每種腺病毒，小鼠體內(nèi)融合蛋白功能實驗均包括2個部分：病毒攻擊保護實驗和免疫效果檢測。同時為了對各組

5、腺病毒免疫保護效果進行全面觀察，每種腺病毒分為1×107PFU/只、1×108PFU/只、1×109PFU/只三個劑量組進行免疫。
　　為了觀察疫苗組小鼠抵抗感病毒的保護能力，分別用5LD50 H1N1（PR8株）和H9N2流感病毒進行攻毒，觀察小鼠在不同劑量組（107PFU、108PFU、109PFU）的生存率、體重下降、肺部及鼻腔病毒滴度等指標。
　　結(jié)果：Western－blot結(jié)果表明，構(gòu)建的6種腺病毒在Hela細胞

6、內(nèi)均可表達出目的大小的融合蛋白。用HA抗體和CD40L抗體分別檢測的結(jié)果分別證實了6種融合蛋白大小及抗原性均正確。免疫熒光的結(jié)果表明，所有6種腺病毒均可以在細胞膜上檢出，說明這6種融合蛋白具有接近天然的生物活性。
　　小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答檢測結(jié)果表明，在第一次免疫兩周后，腺病毒載體SHA2FCD40L、S2HA2FCD40L疫苗3個劑量組都能夠檢測到分泌TNF-α，IFN-γ及IL-4的T細胞。此外，細胞免疫應(yīng)答的水平與疫苗的免疫劑量

7、呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系，即隨著免疫劑量的增加，誘導機體的細胞免疫應(yīng)答的水平也隨之上升。二次免疫后，SHA2FCD40L,S2HA2FCD40L和SHA2組刺激產(chǎn)生的細胞因子明顯增多。其中Ad-S2HA2FCD40L誘導的細胞免疫應(yīng)答較強。與初次免疫相比，二次加強免疫能夠顯著性地增強機體的細胞免疫應(yīng)答水平，并且細胞免疫應(yīng)答水平與免疫劑量呈正相關(guān)。雖然流式細胞檢測結(jié)果表明腺病毒空載體可以刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,但綜合ELISPOT結(jié)果分析不是針對

8、HA2蛋白產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答。
　　體液免疫檢測結(jié)果表明，AD-SHA2、AD-SHA2FCD40L和AD-S2HA2FCD40L三種腺病毒載體疫苗組都能夠誘導機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。體液免疫應(yīng)答的水平與疫苗的免疫劑量呈正相關(guān)，其中后2組有更高的IgG和IgA抗體分泌，
　　動物保護實驗結(jié)果表明，109PFU的AD-SHA2腺病毒載體疫苗對PR8和H9N2有一定的交叉保護作用，其體內(nèi)的病毒滴度水平也相對較低。小鼠肺部和鼻腔中