新型結(jié)核疫苗實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、結(jié)核感染嚴(yán)重威脅著人類健康。全世界約1/3人口感染結(jié)核，其中5-10[％]會發(fā)病。更為嚴(yán)重的是近十幾年來由于多耐藥結(jié)核的播散和HIV/AIDS的蔓延，結(jié)核病發(fā)病率不斷增高。BCG是目前全球廣泛使用的唯一的結(jié)核病疫苗。盡管BCG對預(yù)防兒童嚴(yán)重的結(jié)核感染有效，但對成人肺結(jié)核的發(fā)生幾乎沒有保護(hù)效率。因此研制新型的結(jié)核疫苗刻不容緩，這對于控制結(jié)核傳染具有非常重大的意義。當(dāng)前疫苗研究的主要方向是：1)研制免疫效力超過BCG的疫苗，如其它活的結(jié)核分

2、枝桿菌菌苗；2)研制亞單位疫苗，用于BCG免疫后加強(qiáng)免疫應(yīng)答。本研究工作也包括兩個方面：重組BCG疫苗的研究和融合蛋白亞單位疫苗的研究。 1．重組BCG疫苗的研究 BCG是很好的活的疫苗載體，可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。將一些重要的結(jié)核桿菌抗原基因?qū)隑CG，讓BCG大量表達(dá)保護(hù)性抗原，有望誘導(dǎo)比BCG強(qiáng)大而又持久的免疫保護(hù)力。本研究選擇結(jié)核分枝桿菌最重要的保護(hù)性抗原Ag85B，將可表達(dá)該基因的piV261

3、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BCG中，構(gòu)建了重組BCG疫苗(rBCG::Ag85B)。我們的研究表明，rBCG:Ag85B菌株可以高效表達(dá)Ag85B，用該菌株免疫小鼠，可以引起較BCG強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。 進(jìn)一步我們觀察了rBCG::Ag85B的免疫保護(hù)效果。皮下免疫C57BL/6小鼠和豚鼠(劑量分別為5×10<'6>和5×10<'4>cfu)，8周后給予結(jié)核桿菌毒力標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv攻擊，觀察攻擊后動物存活時間、體重變化、組織病理變化和菌

4、落計(jì)數(shù)。研究結(jié)果顯示在結(jié)核桿菌毒力株攻擊后一定時間內(nèi)(小鼠和豚鼠分別為10、12周)rBCG::Ag85B和BCG組對于結(jié)核感染均具有保護(hù)作用，二者保護(hù)效率近似，尚不能觀察到明顯差異。為了進(jìn)一步區(qū)分重組BCG與BCG疫苗的保護(hù)效率差異，需要延長毒力株攻擊后觀察時間。 2．融合蛋白亞單位疫苗的研究將Ag85B、MPT64<,190-198>和Mtb8．4三種重要的保護(hù)性抗原物質(zhì)融合表達(dá)，構(gòu)建了融合多肽AMM。其中MPT64<,1

5、90-198>是抗原MPT64第190-198位氨基酸，是一CD8+T細(xì)胞表位。表達(dá)純化AMM蛋白，將其和IFA混合免疫小鼠。研究表明它可以激活有效的細(xì)胞免疫和體液免疫。AMM的兩個組分Ag85B和MPT64<,190-198>均可刺激免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞表達(dá)分泌IFN-γ。此外，和Ag85B比較，AMM誘導(dǎo)更高水平的體液免疫應(yīng)答。 殼聚糖(Chitosan)微球體是近年來發(fā)展起來的新型粘膜藥物和疫苗運(yùn)輸載體。參照文獻(xiàn)方法我們制備

6、了殼聚糖微球體，它可以和AMM蛋白高效結(jié)合，且不易解離。結(jié)合AMM蛋白的殼聚糖微球體直徑約5．78±0.65μ m。分別在第1、3、5周用該疫苗皮下免疫小鼠3次，最后1次免疫3周后，檢測血清抗體水平與脾細(xì)胞可分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明血清IgG(H+L)、IgG1、IgG2a水平均有所增強(qiáng)；免疫小鼠脾細(xì)胞受到特異性抗原刺激后，有較多的淋巴細(xì)胞分泌表達(dá)IFN-γ；尤其是用CD8<'+>T細(xì)胞表位MPT64抗原190-198位肽片段可