新型流感病毒樣顆粒疫苗在老齡小鼠中免疫原性研究.pdf

1、目的：流感病毒是一類具有高度傳染性的呼吸道病毒，每年全球有25-50萬人因感染流感病毒致病或死亡。老齡人群由于免疫衰老對包括流感病毒在內的傳染性疾病的發(fā)病率和死亡率均高于成年人。預防流感最有效的方法為疫苗接種，但研究表明傳統(tǒng)流感疫苗在老齡人口中的有效性只有不足50％，而在成年人中有效性可達90％。隨著世界人口老齡化日益嚴重，研發(fā)針對老齡人群安全有效的新型流感疫苗意義重大。為此，我們分別用整合免疫佐劑和改變免疫途徑兩種方法，探討流感病毒V

2、LPs在老齡小鼠中的免疫原性，希望為研發(fā)針對老齡人群的高效新型流感疫苗提供實驗室依據(jù)，從而啟示其他老年性疾病疫苗的開發(fā)和應用。
　　方法：整合了免疫佐劑的新型流感病毒樣顆粒（Virus-likeparticles，VLPs）疫苗，通過不同免疫途徑，探討以H1N1流感病毒A/PertoRico/8/34（PR8）為基礎的VLPs在老齡小鼠中的免疫原性。（1）利用昆蟲重組桿狀病毒（Recombinantbaculovirus，rBVs

3、）表達系統(tǒng)，將整合有免疫佐劑－細菌鞭毛蛋白flagellin的PR8流感病毒血凝素蛋白HA及野生型流感病毒HA分別與神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)和基質蛋白（Matrixproteins，M1）共表達，在體外組裝成新型流感病毒樣顆粒，分別命名為Flic-PR8VLPs和PR8VLPs。用電鏡觀察VLPs的形態(tài)，WesternBlot方法檢測flagellin、HA和M1的含量，血凝實驗檢測HA活性，定量ELISA方法計算

4、每微克VLPs中的HA實際含量，并用制備的VLPs刺激骨髓來源的樹突狀細胞，采用CytokineELISA方法測定VLPs體外生物學活性。（2）HA含量和活性相同的Flic-PR8VLPs和PR8VLPs分別通過肌肉注射免疫老齡小鼠和成年小鼠，初次免疫四周后加強免疫一次。每次免疫兩周后采用眶后靜脈叢刺破法采血，用ELISA方法鑒定血清中抗HA特異性抗體的產(chǎn)生，血凝抑制實驗計算抗體滴度。加強免疫四周后，用致死量的同源鼠適應流感病毒A/PR

5、/8/34，或者異源鼠適應流感病毒A/California/04/2009進行攻毒。攻毒后每天固定時間對小鼠稱重并觀察發(fā)病情況，攻毒后15天對小鼠采取安樂處死，取脾臟淋巴細胞，進行ELISPOT檢測特異性細胞因子的產(chǎn)生。（3）2μgPR8VLPs分別通過肌肉注射（IM）和皮內注射（ID）兩種途徑免疫老齡小鼠和成年小鼠，免疫過程如前，用ELISA方法鑒定血清中抗HA特異性抗體的產(chǎn)生，血凝抑制實驗計算抗體滴度。加強免疫四周后，用致死量的同源

6、鼠適應流感病毒A/PR/8/34，或者異源鼠適應流感病毒A/California/04/2009進行攻毒。攻毒后每天固定時間對小鼠稱重并觀察發(fā)病情況，攻毒后15天對小鼠采取安樂處死，取脾臟淋巴細胞，ELISPOT檢測特異性細胞因子的產(chǎn)生。
　　結果：（1）VLPs特性檢測結果：經(jīng)純化的Flic-PR8VLPs和PR8VLPs均保持了與流感病毒粒子相似的形態(tài)及大小，說明整合flagellin并不影響VLPs的正常結構。Western

7、Blot與血凝實驗結果表明，F(xiàn)lic-PR8VLPs和PR8VLPs中HA含量相同且具有正常的生物學活性；定量ELISA顯示，每微克Flic-PR8VLPs和PR8VLPs均含有約6.8納克HA蛋白；CytokineELISA表明，無論在成年小鼠還是老齡小鼠中Flic-PR8VLPs和PR8VLPs均能刺激樹突狀細胞產(chǎn)生細胞因子TNF-α，但是Flic-PR8VLPs刺激TNF-α產(chǎn)生的能力更強，并且增加Flic-PR8VLPs刺激濃度

8、對TNF-α產(chǎn)生影響不大，充分說明了flagellin作為免疫佐劑在其中發(fā)揮了重要免疫增強作用。（2）VLPs免疫小鼠體內免疫應答反應檢測結果：分別用Flic-PR8VLPs和PR8VLPs經(jīng)肌肉注射途徑免疫小鼠，成年小鼠組體內產(chǎn)生的血清特異性抗體水平顯著高于老齡小鼠組。然而在老齡小鼠組內，經(jīng)加強免疫后Flic-PR8VLPs與PR8VLPs相比，前者能誘導更高水平的IgG，且以IgG2a亞型為主。血凝抑制實驗結果顯示，血清HI滴度在F

9、lic-PR8VLPs免疫的老齡小鼠組達到了214，而PR8VLPs免疫的老齡小鼠組其滴度只有128，前者為后者的1.7倍，該結果與ELISA結果相符，說明Flic-PR8VLPs能誘導更高效的抗HA抗體。（3）病毒攻擊實驗結果：用致死劑量同源鼠適應A/PR/8/34流感病毒攻擊時，雖然PR8VLPs和Flic-PR8VLPs均能夠對被免疫老齡小鼠提供一定的保護作用，但對老齡小鼠的保護效果明顯劣于成年小鼠組，體現(xiàn)在老齡小鼠體重下降程度較

10、大，然而用致死劑量異源鼠適應A/California/04/2009流感病毒攻擊時，只有Flic-PR8VLPs能夠對被免疫小鼠提供保護作用，而PR8VLPs免疫的小鼠全部死亡，充分說明Flic-PR8VLPs具有更好的免疫原性。（4）不同免疫途徑免疫應答反應結果：PR8VLPs經(jīng)IM和ID途徑分別免疫小鼠后，IM組中成年小鼠組HA特異性IgG抗體水平略高于ID組，與之相反的是，在老齡小鼠組，雖然經(jīng)IM與ID免疫所產(chǎn)生的抗體水平均較成年

11、小鼠組低15倍之多，但是ID組產(chǎn)生的IgG抗體水平約為IM組的1.5倍。進一步應用ELISA方法對IgG亞型抗體分析表明，在老齡小鼠中，經(jīng)ID途徑免疫能夠誘發(fā)更高水平的抗原特異性IgG1產(chǎn)生，說明ID途徑免疫能夠通過Th2型免疫反應提高流感病毒VLPs在老齡小鼠中的免疫原性。與ELISA結果相符，經(jīng)ID免疫的老齡小鼠組HI滴度達到了288，而IM免疫的老齡小鼠組HI滴度只有100，前者為后者的2.8倍左右，表明ID途徑免疫能誘導高效價的

12、抗HA抗體產(chǎn)生。（5）不同免疫途徑條件下病毒攻擊實驗結果：ID途徑免疫可提高對老齡小鼠免疫原性，主要表現(xiàn)在用致死劑量同源鼠適應A/PR/8/34流感病毒攻擊時，IM與ID均能夠對被免疫老齡小鼠提供一定程度保護作用，但對老齡小鼠的保護效果明顯劣于成年小鼠組，表現(xiàn)在老年小鼠體重下降程度較大。但是用致死劑量異源鼠適應性A/California/04/2009流感病毒攻擊，只有ID途徑免疫PR8VLPs能夠對被免疫老齡小鼠提供保護，而IM途徑免

13、疫PR8VLPsI的老齡小鼠全部死亡。
　　結論：（1）成功制備了整合免疫佐劑的流感病毒Flic-PR8VLPs和野生型流感病毒PR8VLPs，兩種流感病毒樣顆粒的HA含量相同。（2）Flic-PR8VLPs和PR8VLPs肌肉注射免疫成年和老齡小鼠，F(xiàn)lic-PR8VLPs顯示較強的免疫原性。（3）肌肉注射和皮內注射兩種途徑免疫成年和老齡小鼠，成年小鼠組中兩種免疫途徑免疫原性未見顯著差異，老齡小鼠組中皮內注射免疫途徑的免疫原性明