豆科牧草生物活性物質(zhì)的提取及功能性研究.pdf

1、本文對以紫花苜蓿葉蛋白為原料采用酶解法制備苜蓿肽制劑的工藝及其功能進行了系統(tǒng)的研究；同時，還系統(tǒng)研究了紅三葉、紫花苜蓿異黃酮的提取、純化、體外抗氧化以及其對小鼠抗氧化、生長、免疫等功能的影響。主要結(jié)果如下： 1.采用水提法從苜蓿干草中提取葉蛋白。通過加鹽量、絮凝溫度、絮凝時間和料水比四因素三水平的正交試驗，得出影響苜蓿干草中葉蛋白提取的最主要因素是料水比。最佳工藝條件為加鹽量1％，預(yù)浸時間24h，打漿5min，料水比1∶20，p

2、H2.5，60℃條件下絮凝5min。 2.采用酶解法以苜蓿葉蛋白為原料制備肽制劑。通過單酶篩選和雙酶組合試驗，確定了復(fù)合胰蛋白酶和北京美的公司堿性蛋白酶為最佳雙酶組合。進一步的單因素和五因素四水平正交試驗結(jié)果表明，雙酶組合的最佳工藝條件為90℃預(yù)熱處理15min，pH值8.6、酶解溫度50℃、酶活添加量5000U/g蛋白、酶活比2∶3(復(fù)合胰蛋白酶：北京美的公司堿性蛋白酶)、底物濃度3％。在此條件下進行水解，水解度為60.73％

3、，酸溶性肽得率為80.25％。液相色譜法測定肽制劑分子量的結(jié)果表明，分子量在1000Da以下的寡肽所占比例為92.82％，其中以分子量為224Da的二肽為主。 3.采用低(0.1mg/ml)、中(1.0mg/ml)、高(5mg/ml)劑量的苜蓿肽制劑溶液對小鼠連續(xù)灌胃21d，進行生長免疫試驗。結(jié)果表明，苜蓿肽制劑對小鼠的生長影響極為顯著。能明顯促進小鼠的生長，顯著提高日增重和降低料重比。尤以低、中劑量組表現(xiàn)最為明顯，日增重分別比

4、對照組提高26.53％和22.45％，料重比分別比對照組降低19.51％和14.01％，與對照組的差異都達到極顯著水平(P＜0.01)；同時，苜蓿肽制劑對小鼠的特異性和非特異性免疫功能都有不同程度的提高和改善作用，表明其中含有免疫活性肽，對提高小鼠的機體免疫水平具有重要的促進作用。 4.采用乙醇溶劑浸提，結(jié)合超聲波輔助提取豆科牧草中的異黃酮。通過提取劑乙醇濃度、提取溫度、提取時間和料液比四因素三水平的正交實驗，得出紅三葉異黃酮最

5、佳提取條件為乙醇濃度70％，料液比1∶25，提取溫度70℃，提取時間1h。在此最佳條件下紅三葉異黃酮的提取量為24.65mg/g，粗提物得率為24.74％，粗提物純度為5.99％；苜蓿異黃酮最佳提取條件為乙醇濃度60％，料液比1∶35，提取溫度50℃，提取時間1.5h。在此最佳條件下苜蓿異黃酮的提取量為l7.12mg/g，粗提物得率為26.15％，粗提物純度為2.94％。 5.通過靜態(tài)吸附、解吸試驗及靜態(tài)吸附動力學(xué)試驗，確定了采

6、用大孔吸附樹脂HPH480對紅三葉和苜蓿異黃酮進行純化。動態(tài)吸附試驗結(jié)果表明，對于紅三葉異黃酮，較好的動態(tài)吸附條件為，上樣液濃度0.8～1.3mg/ml，上樣液pH為5，徑高比1∶20，不需要預(yù)吸附，流速2ml/min，室溫下上樣，采用70％乙醇室溫洗脫，流速為1.0ml/min，洗脫劑用量為4BV，在此條件下得到的紅三葉異黃酮純度可在25％以上，較粗提物提高4倍以上；對于苜蓿異黃酮，較好的動態(tài)吸附條件為，上樣液濃度0.6～1.2mg/

7、ml，上樣液pH為5，徑高比1∶20，預(yù)吸附4h，流速2ml/min，上樣液溫度40℃，采用80％乙醇60℃洗脫，流速為1.0ml/min，洗脫劑用量為4BV，在此條件下得到的苜蓿異黃酮純度可在10％以上，較粗提物提高3倍以上。 液相色譜檢測結(jié)果表明，經(jīng)水解處理的紅三葉異黃酮主要含有大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆芽素，其中以刺芒柄花素含量最高。 6.采用樹脂吸附法與溶劑萃取法聯(lián)用對異黃酮進行精制以乙酸乙酯萃取效果

8、較好，可使紅三葉異黃酮純度達到32.29％，苜蓿異黃酮純度達到13.69％；紅三葉異黃酮精制采用樹脂吸附法與重結(jié)晶法聯(lián)用，純度可達44.78％，但重復(fù)性差。 7.體外抗氧化試驗表明，紅三葉和苜蓿異黃酮粗提物對豬油都有明顯的抗氧化效果，且以添加0.2％者抗氧化效果最好。0.2％紅三葉提取物比常用抗氧化劑BHT的效果還好，與VC相當(dāng)；而0.2％苜蓿提取物的抗氧化效果不如常用抗氧化劑BHT和VC。同時，紅三葉和苜蓿異黃酮粗提物與VC和

9、VE都有極顯著的協(xié)同抗氧化效果，強于任何單一抗氧化劑，并可節(jié)省抗氧化劑用量。 8.對D-半乳糖(250mg/Kg.d)致衰老模型小鼠，分別用低、中、高三個劑量組的紅三葉異黃酮(30、90、300mg/kg·d)和苜蓿異黃酮(40，120，400mg/kg·d)連續(xù)灌胃30d，進行體內(nèi)抗氧化試驗。結(jié)果表明紅三葉和苜蓿異黃酮具有顯著提高小鼠血清及肝組織中SOD、GSH-Px，減少其MDA含量的作用，能較好地清除氧自由基，防止細(xì)胞損傷

10、，證明紅三葉和苜蓿異黃酮在抗氧化、防衰老方面具有重要意義。 9.采用低、中、高三個劑量組的紅三葉異黃酮(30、90、300mg/kg·d)和苜蓿異黃酮(40，120，400mg/kg·d)對小鼠連續(xù)灌胃21d，進行生長免疫試驗。結(jié)果表明，紅三葉和苜蓿異黃酮對小鼠生長的影響呈現(xiàn)性別差異。低劑量的紅三葉和苜蓿異黃酮對雄性小鼠有極顯著的促生長作用(P＜0.01)，胃重也顯著增加(P＜0.05)，隨著異黃酮用量的加大，日增重呈下降趨勢，

11、但仍有一定的促生長作用；而低、中劑量的紅三葉和苜蓿異黃酮對雌性小鼠沒有促生長作用，高劑量的異黃酮還有使雌性小鼠日增重明顯下降的趨勢，比對照組分別下降19.61％和23.53％。由此可見異黃酮對動物肌肉生長和內(nèi)分泌的影響存在劑量效應(yīng)關(guān)系，低劑量應(yīng)用時表現(xiàn)正效應(yīng)，高劑量時表現(xiàn)負(fù)效應(yīng)。選擇合適的劑量非常重要。免疫試驗表明，紅三葉和苜蓿異黃酮對小鼠的特異性和非特異性免疫功能都有不同程度的提高和改善作用，表明苜蓿和紅三葉異黃酮對提高小鼠的機體免疫