基于連續(xù)進(jìn)樣的微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)在DNA分析中的應(yīng)用.pdf

1、DNA是遺傳信息的載體，基因序列的改變與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，對(duì)于突變基因的檢測(cè)是腫瘤研究的重要課題。快速、高效的DNA分析技術(shù)是對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷和治療的重要手段。
　　 毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis）技術(shù)以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)樣品中各組分之間遷移速度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。其高效，快速，靈敏度高的特點(diǎn)使其在DNA分析方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。

2、
　　 微流控芯片分析系統(tǒng)(Microfluidic analysis system)是基于物理學(xué)、分析化學(xué)、生物學(xué)等多學(xué)科研究領(lǐng)域而發(fā)展起來的微生化分析工具，通過對(duì)微流體的操縱和控制，將分析實(shí)驗(yàn)室的取樣、試樣預(yù)處理、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等功能集成在微芯片上進(jìn)行，其目的是通過分析儀器的微型化和集成化，極大限度的把分析實(shí)驗(yàn)室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的分析設(shè)備中，甚至集中到方寸大小芯片上，因此又被稱為微全分析系統(tǒng)(uTAS，Miniaturiz

3、ed Total Analysis Systems)或芯片實(shí)驗(yàn)室(LOC,LAB-ON-CHIP).微流控芯片具有分析速度快，靈敏度高,易于集成化自動(dòng)化的特點(diǎn)，在樣品分析中有著顯著的優(yōu)勢(shì).
　　 微流控芯片的主要形式是芯片毛細(xì)管電泳，兩者結(jié)合將毛細(xì)管電泳中的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移到芯片平臺(tái)，把毛細(xì)管作為微流控芯片分離部分的主體。在DNA分離分析領(lǐng)域，由于芯片的微通道面積-體積比顯著增大，焦耳熱能很快向四周溢散，故可施加毛細(xì)管電泳難以達(dá)到的高

4、場(chǎng)強(qiáng)，微芯片的快速、高效的分離效能在DNA分析中得到了充分體現(xiàn)。
　　 隨著需要分析的基因數(shù)量的增加，高通量、自動(dòng)化的檢測(cè)技術(shù)變得更加重要。高效、快速、連續(xù)試樣引入系統(tǒng)是微流控芯片系統(tǒng)進(jìn)一步發(fā)展和實(shí)用化的重要保證，有利于整個(gè)微分析系統(tǒng)的真正實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化。
　　 本研究在通過優(yōu)化試驗(yàn)條件后，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA樣品快速高效的單通道檢測(cè)，進(jìn)而采用兩套連續(xù)進(jìn)樣的微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)對(duì)不同DNA樣品進(jìn)行連續(xù)分離分析。
　　

5、 材料與方法：
　　 一、微流控毛細(xì)管電泳DNA分離系統(tǒng)的建立
　　 1．微流控毛細(xì)管電泳DNA分離系統(tǒng)的優(yōu)化
　　 (1)篩分系統(tǒng)場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化：在相同篩分濃度下，在液芯波導(dǎo)-熒光檢測(cè)的連續(xù)進(jìn)樣微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中考察不同場(chǎng)強(qiáng)140V/cm、180V/cm、220V/cm、260V/cm、300V/cm對(duì)分離效能的影響；在激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)的連續(xù)進(jìn)樣微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中考察不同場(chǎng)強(qiáng)120V/cm、180V/cm

6、、240V/cm對(duì)分離效能的影響。
　　 (2)篩分介質(zhì)濃度的優(yōu)化：在相同的180V/cm場(chǎng)強(qiáng)下，在液芯波導(dǎo)-熒光檢測(cè)的連續(xù)進(jìn)樣微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中考察1.0％、2.0％、3.0％、4％、5％不同濃度PVP對(duì)篩分效能的影響；在激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)的連續(xù)進(jìn)樣微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中考察1.0％、2.0％、3.0％、4％、5％不同濃度HPC對(duì)篩分效能的影響。
　　 (3)緩沖液組成成分的選擇：在液芯波導(dǎo)-熒光檢測(cè)的連續(xù)進(jìn)樣微流控

7、毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中常規(guī)選取1×TBE，2×TBE及3×TBE作為緩沖液，考察不同離子濃度緩沖液對(duì)篩分效能的影響；在激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)的連續(xù)進(jìn)樣微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中選取1×TBE、2×TBE、3×TBE及4×TBE作為緩沖液，考察不同離子濃度緩沖液對(duì)篩分效能的影響。
　　 二、微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)在DNA分離分析中的應(yīng)用
　　 1．在兩套系統(tǒng)中對(duì)擁有多片段的DNA Marker進(jìn)行分離分析，并將單片段的DNA與DNA Mar

8、ker混合后進(jìn)行分離分析?？疾煜到y(tǒng)對(duì)不同DNA樣品的分離分析能力。
　　 2．在兩套系統(tǒng)中對(duì)離子濃度高的RFLP酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離分析?？疾煜到y(tǒng)對(duì)復(fù)雜DNA樣品的分離分析能力。
　　 2．在微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)不同DNA樣品連續(xù)分離分析
　　 1、在液芯波導(dǎo)-熒光檢測(cè)的連續(xù)進(jìn)樣微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行連續(xù)分離分析。
　　 2、在激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)的連續(xù)進(jìn)樣微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中對(duì)DNA Ma

9、rker，PCR產(chǎn)物及RFLP酶切樣品進(jìn)行連續(xù)分離分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、微流控毛細(xì)管電泳DNA分析系統(tǒng)的優(yōu)化
　　 1、篩分系統(tǒng)場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化：在相同的篩分濃度下，隨著場(chǎng)強(qiáng)的增加其分離時(shí)間縮短，但分離度也隨之下降。兩套系統(tǒng)分別在220V/cm，180V/cm的場(chǎng)強(qiáng)可在10min左右成功分離φX174-HaeⅢ digest DNA marker，271bp與281bp片段可完全達(dá)到基線分離。
　　

10、 2、篩分介質(zhì)濃度的優(yōu)化：在相同的場(chǎng)強(qiáng)下，隨濃度的增加分離效能越好但分離時(shí)間越長，粘滯度越大，實(shí)驗(yàn)證明兩套系統(tǒng)分別在4％PVP，2％HPC可以達(dá)到較好的篩分效果且粘滯度小容易充入微通道。
　　 3、緩沖液組成的選擇：選取1XTBE，2XTBE，3XTBE及4XTBE作為緩沖溶液，實(shí)驗(yàn)證明緩沖液濃度越大，在相同篩分介質(zhì)的濃度下分離度越好，同時(shí)對(duì)于樣本檢測(cè)的敏感度也顯著提高，但濃度增大的同時(shí)分離時(shí)間也相應(yīng)的增加，因此分別選取4XT

11、BE、3XTBE作為篩分介質(zhì)緩沖液。
　　 二、微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)在不同DNA分析上的應(yīng)用
　　 1、對(duì)DNA Marker的分離：在兩套系統(tǒng)中運(yùn)用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)擁有不同片段的DNA Marker進(jìn)行分離分析。
　　 2、在兩套系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了對(duì)PCR產(chǎn)物的分離分析。
　　 3、在兩套系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)對(duì)RFLP酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離分析。
　　 三、在微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)不同DNA樣品的連續(xù)分離分析

12、>　　 1、在兩套連續(xù)進(jìn)樣的系統(tǒng)對(duì)同一濃度的DNA樣品實(shí)現(xiàn)連續(xù)分離分析，并對(duì)不同濃度的DNA樣品實(shí)現(xiàn)連續(xù)的分離分析，可達(dá)到連續(xù)多個(gè)樣品。
　　 2、在激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)的連續(xù)進(jìn)樣微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)DNA Marker和RFLP酶切產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)連續(xù)分離分析，連續(xù)分析多個(gè)樣品。
　　 結(jié)論：
　　 采用集成有連續(xù)進(jìn)樣系統(tǒng)的液芯波導(dǎo)-熒光檢測(cè)微流控毛細(xì)管電泳平臺(tái)和激光誘導(dǎo)熒光微流控毛細(xì)管電泳平臺(tái)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA