基于連續(xù)進樣的微流控毛細管電泳系統(tǒng)在DNA分析中的應用.pdf

1、DNA是遺傳信息的載體，基因序列的改變與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，對于突變基因的檢測是腫瘤研究的重要課題?？焖佟⒏咝У腄NA分析技術是對腫瘤進行早期診斷和治療的重要手段。
　　 毛細管電泳（Capillary Electrophoresis）技術以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力，根據(jù)樣品中各組分之間遷移速度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術。其高效，快速，靈敏度高的特點使其在DNA分析方面具有顯著的優(yōu)勢。

2、
　　 微流控芯片分析系統(tǒng)(Microfluidic analysis system)是基于物理學、分析化學、生物學等多學科研究領域而發(fā)展起來的微生化分析工具，通過對微流體的操縱和控制，將分析實驗室的取樣、試樣預處理、反應、分離和檢測等功能集成在微芯片上進行，其目的是通過分析儀器的微型化和集成化，極大限度的把分析實驗室的功能轉移到便攜的分析設備中，甚至集中到方寸大小芯片上，因此又被稱為微全分析系統(tǒng)(uTAS，Miniaturiz

3、ed Total Analysis Systems)或芯片實驗室(LOC,LAB-ON-CHIP).微流控芯片具有分析速度快，靈敏度高,易于集成化自動化的特點，在樣品分析中有著顯著的優(yōu)勢.
　　 微流控芯片的主要形式是芯片毛細管電泳，兩者結合將毛細管電泳中的毛細管轉移到芯片平臺，把毛細管作為微流控芯片分離部分的主體。在DNA分離分析領域，由于芯片的微通道面積-體積比顯著增大，焦耳熱能很快向四周溢散，故可施加毛細管電泳難以達到的高

4、場強，微芯片的快速、高效的分離效能在DNA分析中得到了充分體現(xiàn)。
　　 隨著需要分析的基因數(shù)量的增加，高通量、自動化的檢測技術變得更加重要。高效、快速、連續(xù)試樣引入系統(tǒng)是微流控芯片系統(tǒng)進一步發(fā)展和實用化的重要保證，有利于整個微分析系統(tǒng)的真正實現(xiàn)高通量和自動化。
　　 本研究在通過優(yōu)化試驗條件后，實現(xiàn)了對DNA樣品快速高效的單通道檢測，進而采用兩套連續(xù)進樣的微流控毛細管電泳系統(tǒng)對不同DNA樣品進行連續(xù)分離分析。
　　

5、 材料與方法：
　　 一、微流控毛細管電泳DNA分離系統(tǒng)的建立
　　 1．微流控毛細管電泳DNA分離系統(tǒng)的優(yōu)化
　　 (1)篩分系統(tǒng)場強的優(yōu)化：在相同篩分濃度下，在液芯波導-熒光檢測的連續(xù)進樣微流控毛細管電泳系統(tǒng)中考察不同場強140V/cm、180V/cm、220V/cm、260V/cm、300V/cm對分離效能的影響；在激光誘導熒光檢測的連續(xù)進樣微流控毛細管電泳系統(tǒng)中考察不同場強120V/cm、180V/cm

6、、240V/cm對分離效能的影響。
　　 (2)篩分介質濃度的優(yōu)化：在相同的180V/cm場強下，在液芯波導-熒光檢測的連續(xù)進樣微流控毛細管電泳系統(tǒng)中考察1.0％、2.0％、3.0％、4％、5％不同濃度PVP對篩分效能的影響；在激光誘導熒光檢測的連續(xù)進樣微流控毛細管電泳系統(tǒng)中考察1.0％、2.0％、3.0％、4％、5％不同濃度HPC對篩分效能的影響。
　　 (3)緩沖液組成成分的選擇：在液芯波導-熒光檢測的連續(xù)進樣微流控

7、毛細管電泳系統(tǒng)中常規(guī)選取1×TBE，2×TBE及3×TBE作為緩沖液，考察不同離子濃度緩沖液對篩分效能的影響；在激光誘導熒光檢測的連續(xù)進樣微流控毛細管電泳系統(tǒng)中選取1×TBE、2×TBE、3×TBE及4×TBE作為緩沖液，考察不同離子濃度緩沖液對篩分效能的影響。
　　 二、微流控毛細管電泳系統(tǒng)在DNA分離分析中的應用
　　 1．在兩套系統(tǒng)中對擁有多片段的DNA Marker進行分離分析，并將單片段的DNA與DNA Mar

8、ker混合后進行分離分析?？疾煜到y(tǒng)對不同DNA樣品的分離分析能力。
　　 2．在兩套系統(tǒng)中對離子濃度高的RFLP酶切產物進行分離分析?？疾煜到y(tǒng)對復雜DNA樣品的分離分析能力。
　　 2．在微流控毛細管電泳系統(tǒng)實現(xiàn)不同DNA樣品連續(xù)分離分析
　　 1、在液芯波導-熒光檢測的連續(xù)進樣微流控毛細管電泳系統(tǒng)中對PCR產物進行連續(xù)分離分析。
　　 2、在激光誘導熒光檢測的連續(xù)進樣微流控毛細管電泳系統(tǒng)中對DNA Ma

9、rker，PCR產物及RFLP酶切樣品進行連續(xù)分離分析。
　　 實驗結果：
　　 一、微流控毛細管電泳DNA分析系統(tǒng)的優(yōu)化
　　 1、篩分系統(tǒng)場強的優(yōu)化：在相同的篩分濃度下，隨著場強的增加其分離時間縮短，但分離度也隨之下降。兩套系統(tǒng)分別在220V/cm，180V/cm的場強可在10min左右成功分離φX174-HaeⅢ digest DNA marker，271bp與281bp片段可完全達到基線分離。
　　

10、 2、篩分介質濃度的優(yōu)化：在相同的場強下，隨濃度的增加分離效能越好但分離時間越長，粘滯度越大，實驗證明兩套系統(tǒng)分別在4％PVP，2％HPC可以達到較好的篩分效果且粘滯度小容易充入微通道。
　　 3、緩沖液組成的選擇：選取1XTBE，2XTBE，3XTBE及4XTBE作為緩沖溶液，實驗證明緩沖液濃度越大，在相同篩分介質的濃度下分離度越好，同時對于樣本檢測的敏感度也顯著提高，但濃度增大的同時分離時間也相應的增加，因此分別選取4XT

11、BE、3XTBE作為篩分介質緩沖液。
　　 二、微流控毛細管電泳系統(tǒng)在不同DNA分析上的應用
　　 1、對DNA Marker的分離：在兩套系統(tǒng)中運用優(yōu)化的實驗條件對擁有不同片段的DNA Marker進行分離分析。
　　 2、在兩套系統(tǒng)中實現(xiàn)了對PCR產物的分離分析。
　　 3、在兩套系統(tǒng)中實現(xiàn)對RFLP酶切產物進行分離分析。
　　 三、在微流控毛細管電泳系統(tǒng)實現(xiàn)不同DNA樣品的連續(xù)分離分析

12、>　　 1、在兩套連續(xù)進樣的系統(tǒng)對同一濃度的DNA樣品實現(xiàn)連續(xù)分離分析，并對不同濃度的DNA樣品實現(xiàn)連續(xù)的分離分析，可達到連續(xù)多個樣品。
　　 2、在激光誘導熒光檢測的連續(xù)進樣微流控毛細管電泳系統(tǒng)中實現(xiàn)DNA Marker和RFLP酶切產物實現(xiàn)連續(xù)分離分析，連續(xù)分析多個樣品。
　　 結論：
　　 采用集成有連續(xù)進樣系統(tǒng)的液芯波導-熒光檢測微流控毛細管電泳平臺和激光誘導熒光微流控毛細管電泳平臺，成功實現(xiàn)了對DNA