微流控溫度梯度毛細(xì)管電泳DNA分析系統(tǒng)的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、腫瘤的發(fā)生是分子上逐步累積的多基因改變的過程，通過基因的篩查可以對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行有效的診斷和預(yù)測，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷和早期治療。單核苷酸構(gòu)象多態(tài)性(Single—nucleotide polymorphisms，SNPs)/基因突變和DNA甲基化是最常見的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變形式，經(jīng)常用作研究疾病的重要分子標(biāo)志物。迄今DNA測序仍是分析檢測基因的金標(biāo)準(zhǔn)，然而其耗時(shí)長、價(jià)格昂貴等特點(diǎn)不適宜大樣本檢測。盡管目前已經(jīng)出現(xiàn)多種檢測基

2、因突變和甲基化的方法，但仍需進(jìn)一步提高檢測速度和準(zhǔn)確性，并降低成本。 溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)技術(shù)是一種穩(wěn)定、高效的測序前基因突變篩查技術(shù)，利用不同構(gòu)象的分子具有不同的50％解鏈溫度(Tm)來進(jìn)行分離和檢測，其最大優(yōu)勢就是無需事先了解突變類型，只要其Tm值處于施加的溫度梯度范圍內(nèi)，就能有效檢測已知和未知突變。但現(xiàn)階段傳統(tǒng)的TGGE技術(shù)中溫度梯度

3、形成系統(tǒng)復(fù)雜，重現(xiàn)性差，而且檢測靈敏度較低。 微全分析系統(tǒng)(Miniaturized total analysis systemsm，μTAS)是基于物理學(xué)、分析化學(xué)、生物學(xué)等多學(xué)科研究領(lǐng)域而發(fā)展起來的微生化分析工具，其目的是通過分析儀器的微型化和集成化，極大限度地把分析實(shí)驗(yàn)室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的分析設(shè)備中，因此又被稱為微流控芯片(microfluidic chip)或芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on a chip，LOC)。微流控芯片具

4、有分析速度快，靈敏度高等優(yōu)勢，樣品消耗可降低至納升級，易于集成化自動(dòng)化的特點(diǎn)更適用于對珍貴臨床試樣的大樣本分析，增加速度，減少污染。 微流控芯片電泳分析系統(tǒng)是在毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種更為優(yōu)化的分析工具。其原理是以電場為驅(qū)動(dòng)力，借助于離子或分子在電泳遷移或分配上的差異，從而實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜試樣中多種組分的分離。由于芯片的微通道面積—體積比顯著增大，焦耳熱能很快向四周溢散，所以可施加平板凝膠電泳難以達(dá)到的高場強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對樣品的快

5、速、高效的分離檢測。 近年來大腸癌發(fā)病率迅速上升，而基因突變和DNA甲基化常發(fā)生在腫瘤早期，對大腸癌的早期診斷具有重要意義。本研究通過微流控溫度梯度毛細(xì)管電泳系統(tǒng)的建立可對大腸癌細(xì)胞系和各種臨床樣本中K—ras基因突變和p16基因啟動(dòng)子甲基化進(jìn)行快速高效檢測，為腫瘤相關(guān)基因的大規(guī)模篩查提供了更為切實(shí)有效的分析工具。 材料與方法： 一、微流控芯片TGCE基因突變檢測系統(tǒng)的建立 1、用標(biāo)準(zhǔn)光刻和濕法刻蝕技術(shù)在

6、玻璃基片上刻蝕出十字形微通道網(wǎng)絡(luò)，采用熱鍵合方法將其與蓋片進(jìn)行封接，在微通道末端粘接儲液池，制成玻璃微流控芯片。搭建共聚焦型激光誘導(dǎo)熒光檢測裝置，設(shè)定電泳進(jìn)樣及分離電壓。 2、基于傾斜式熱輻射溫度梯度形成系統(tǒng)的建立 將一程序控溫鋁塊放置于玻璃微流控芯片上，通過在芯片與鋁塊接觸面的上游邊緣放置一條絕緣絲線，則分離通道自上游向下游會因獲得的輻射熱逐漸增加而溫度逐漸升高，從而形成一個(gè)連續(xù)的溫度梯度。 3、四種具有不同片

7、段長度和較大Tm值范圍的點(diǎn)突變模式樣品分別在有效溫度梯度范圍為3.0cm的5℃溫度梯度(1.7℃cm—1)和10℃溫度梯度(3.3℃cm—1)下進(jìn)行微流控芯片TGCE檢測。電泳有效分離距離為4.5cm，每次電泳分離時(shí)間少于7min。 二、微流控芯片TGCE檢測K—ras基因突變 1、微流控芯片TGCE檢測6種大腸癌細(xì)胞系K—ras基因突變。 2、根據(jù)密碼子12突變與否，分別按不同比例將野生型HT29和突變型SW4

8、80細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)：1:1，4：1，16：1，64：1，128：1，256：1，512：1，考察系統(tǒng)對突變型K—ras的檢出限。 3、對83例大腸癌患者石蠟切片進(jìn)行檢測，考察微流控芯片TGCE的篩分系統(tǒng)與直接PCR產(chǎn)物測序相比對大腸癌的篩查是否有意義。 4、微流控芯片TGCE檢測20例大腸癌患者的腫瘤組織和糞便樣品中K—ras基因突變情況，與PCR產(chǎn)物測序法比較檢出率和符合率。 5、定量分析突變型比例

9、采用AutoCAD軟件獲得同源雙鏈和異源雙鏈下的峰面積后，計(jì)算異源雙鏈峰面積占總峰面積的百分比就可以得到突變型的比例，用克隆測序獲得的突變型比例對芯片檢測結(jié)果進(jìn)行校正，獲得回歸方程。 三、基于微流控芯片TGCE基因甲基化檢測方法的建立 1、亞硫酸氫鹽—微流控芯片TGCE甲基化檢測系統(tǒng)的建立 利用亞硫酸氫鹽可特異性地將未甲基化的胞嘧啶修飾轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(C→U)，而對甲基化的胞嘧啶無修飾作用的特點(diǎn)，將靶序列原來甲基化

10、位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)差異轉(zhuǎn)化成了核苷酸點(diǎn)突變(C→T)，將能夠進(jìn)行基因突變檢測的溫度梯度毛細(xì)管電泳(TGCE)應(yīng)用到了甲基化檢測中。 2、檢測甲基化模式樣品 分別從具有不同p16基因啟動(dòng)子甲基化模式的大腸癌細(xì)胞系獲得完全甲基化和非甲基化模式片段。通過甲基轉(zhuǎn)移酶修飾法和去甲基化法獲得多種具有不同甲基化位點(diǎn)的p16基因啟動(dòng)子片段，分別與非甲基化片段以等比混合變性復(fù)性后，在5℃和10℃溫度梯度下進(jìn)行微流控芯片TGCE檢測。復(fù)雜甲基

11、化樣品PCR產(chǎn)物直接變性復(fù)性在5℃和10℃溫度梯度下檢測。 3、微流控芯片TGCE檢測p16基因啟動(dòng)子甲基化情況已知的4種大腸癌細(xì)胞系和未知的3種大腸癌細(xì)胞系的該基因甲基化狀態(tài)。 4、系統(tǒng)檢出限的考察 根據(jù)p16基因啟動(dòng)子甲基化與否，將非甲基化HT29細(xì)胞系和甲基化SW480細(xì)胞系的PCR產(chǎn)物等比混合、變性復(fù)性后稀釋50倍、100倍、200倍、400倍和800倍進(jìn)樣電泳檢測，確定系統(tǒng)對DNA分子的檢出限。分別按不

12、同比例將非甲基化LS174T細(xì)胞系和甲基化SW480細(xì)胞系的PCR擴(kuò)增片段按下列比例進(jìn)行混合：1:1，4：1，16：1，64：1，128：1，256：1和512：1，微流控芯片TGCE檢測確定其對甲基化片段的檢出限。 5、亞硫酸氫鹽—微流控芯片TGCE檢測20例大腸癌患者的腫瘤組織和配對糞便樣品的p16基因甲基化狀態(tài)。 結(jié)果： 一、微流控芯片TGCE基因突變檢測系統(tǒng)的建立 本研究以從4種單點(diǎn)突變質(zhì)粒中擴(kuò)增

13、出的具有較大變性溫度范圍的PCR產(chǎn)物作為實(shí)驗(yàn)材料，首次將TGCE過程移植到微流控芯片上，建立了一種簡單、高效、低成本的快速檢測基因突變的分析技術(shù)平臺。該裝置在3cm的加熱區(qū)域內(nèi)通過熱輻射差異形成了芯片分離通道內(nèi)穩(wěn)定而重現(xiàn)性好的溫度梯度，并且隨著絲線直徑的變化，溫度梯度能夠在3—10℃的范圍內(nèi)任意調(diào)節(jié)。應(yīng)用該體系，實(shí)現(xiàn)了在最大10℃梯度(3.3℃cm—1)內(nèi)對DNA點(diǎn)突變進(jìn)行檢測，由于一般DNA片段的變性溫度都位于10℃梯度內(nèi)，使得這一方

14、法應(yīng)用于檢測未知突變成為可能，而不必知道具體的突變位置和突變類型。 二、微流控芯片TGCE檢測K—ras基因突變 基于傾斜式熱輻射的微流控芯片TGCE系統(tǒng)對基因突變檢測的有效性進(jìn)一步通過檢測6種大腸癌細(xì)胞系K—ras基因突變得到了驗(yàn)證。該系統(tǒng)對比例混合細(xì)胞中突變型K—ras的檢出限可達(dá)1/513。用克隆測序檢測的突變型K—ras比例對芯片電泳檢測的突變型比例進(jìn)行校正，以從電泳結(jié)果計(jì)算精確的突變型比例，回歸方程為y=0.9

15、93x—1.387。對84例石蠟切片K—ras基因檢測結(jié)果顯示，微流控芯片TGCE的檢出率明顯高于PCR產(chǎn)物直接測序。結(jié)合臨床資料分析，當(dāng)腫瘤位于直腸時(shí)，以及浸潤深度達(dá)全層時(shí)K—ras基因突變率顯著增加。對20例大腸癌腫瘤組織和配對糞便樣品進(jìn)行微流控芯片檢測的結(jié)果顯示，K—ras基因突變的檢出率，以及糞便樣品與腫瘤組織中K—ras基因突變的符合率，均明顯高于PCR產(chǎn)物直接測序。 三、基于微流控芯片TGCE基因甲基化檢測方法的建立

16、 用亞硫酸氫鹽修飾法使基因甲基化的差異轉(zhuǎn)化為基因多點(diǎn)突變，建立了基因甲基化檢測的亞硫酸氫鹽—微流控溫度梯度毛細(xì)管電泳法(bisulfite—μTGCE)。分別在5℃和10℃溫度梯度下完成了具有1個(gè)、2個(gè)、5個(gè)、12個(gè)、30個(gè)和35個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化模式樣品和復(fù)雜甲基化樣品的檢測。應(yīng)用此方法，完成了7種大腸癌細(xì)胞系p16基因啟動(dòng)子甲基化的檢測。該系統(tǒng)檢測靈敏度可達(dá)0.5ng/μl，對比例混合細(xì)胞中甲基化片段的檢出限可達(dá)1/257