人巨細胞病毒UL82基因重組質粒的構建及其在大腸桿菌中的表達.pdf

1、人巨細胞病毒(HCMV)含有約20-25種蛋白質,其中在介導HCMV感染和病毒復制中有3種蛋白作用最為重要,即由ORFUL82編碼的磷蛋白pp71、ORF UL83編碼的pp65蛋白和ORF UL69編碼的pUL69蛋白.上述3種蛋白共同的特點是啟動HCMV對宿主細胞的感染和病毒的復制,同時在逃逸T淋巴細胞介導的細胞毒性作用中也具有重要作用.新近的研究表明,在這3種間層蛋白中以ORFUL82編碼的蛋白pp71的作用最為顯著,該PP71蛋

2、白單獨存在時,是一種較強的抗原蛋白,可刺激機體產生抗體,有助于清除病毒;在器官移植者,HCMV的感染后pp71蛋白的產生可以明顯增強細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達,從而引起移植物血管病變和排斥反應<'[1]>;在視網膜母細胞瘤,pp71蛋白的產生可以引起腫瘤蛋白p105,p107,p130等的衰變<'[2,3]>.Pp71蛋白可以誘導靜止的細胞進入細胞周期并使他們停在G1晚期,而這段時期對病毒復制最為有利,所以它能夠增加病毒繁

3、殖,加快病毒在細胞間傳遞,體外將HCMV轉染人纖維母細胞后,病毒DNA復制效率在共轉染ORF UL82(pp71蛋白)條件下,感染及復制效率增加了80倍<'[4~8]>.研究證實pp71不僅對HCMV的IE1和IE2基因表達有促進作用,而且對晚期基因的表達以及病毒向正常宿主細胞的傳播具有促進和加強作用.因此,Baldick指出,ORF UL82(pp71蛋白)可作為抗CMV病毒藥物設計的有效靶點<'[9]>.為了進一步研究PP71蛋白基

4、因在大腸桿菌(E.coli)中的表達,為下一步蛋白的大量表達純化和基因工程抗體庫的篩選奠定基礎.該研究進行了以下工作:1. 人巨細胞病毒的培養(yǎng)..在傳代培養(yǎng)的人包皮成纖維細胞(HFF)中接種人巨細胞病毒,并在含2﹪小牛血清的DMEM維持液中繼續(xù)培養(yǎng)至絕大多數的細胞都出現了明顯的細胞病變效應(CPE)時,凍融法收獲細胞,保存在-70℃.免疫組化方法檢測培養(yǎng)細胞中的pp65抗原顯示絕大多數的細胞已經成功感染了巨細胞病毒.2. 人巨細胞病毒p

5、p71基因的克隆及pGEX/pp71重組表達質粒的構建(1)利用蛋白酶K法提取HCMV DNA.(2)設計引物、PCR擴增pp71基因目的片段.(3)BamHI和EcoRI內切酶雙酶切目的片段和質粒pGEX-4T-1.并將pp71基因目的片段連接到pGEX-4T-1上.利用氯化鈣法將重組質粒pGEX/pp71轉入DH5a大腸桿菌內.(4)提取重組質粒pGEX/pp71,以BamHI和EcoRI雙酶切方法和PCR方法初步鑒定重組質粒,