日本對(duì)蝦CyclinB基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、cvclin B又稱細(xì)胞周期蛋白B，在G2期或G2/M轉(zhuǎn)變期發(fā)揮著重要的作用。調(diào)節(jié)亞基cyclin B和催化亞基P34cdc2結(jié)合，組成M期促進(jìn)因子MPF(M phase promoting factor)，又稱成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor)，為物種間高度保守的啟動(dòng)細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期的一個(gè)非常重要的蛋白激酶。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中起中心調(diào)控作用。在哺乳類和魚類中研究發(fā)現(xiàn)MPF激活主要依賴于

2、cclin B蛋白合成及P34cdc2的142Thr(蘇氨酸)和152Tyr(酩氨酸)位點(diǎn)發(fā)生去磷酸化。在此過程中細(xì)胞周期蛋白B及其相關(guān)調(diào)控蛋白 Mos，mytl，和plxl，cdc25蛋白起了關(guān)鍵性的作用。有關(guān)cyclin B的研究目前主要集中在人、鼠等哺乳動(dòng)物以及爪蟾、海星和一些魚類(如鯉魚，鯰魚，金魚)。相比于其它類的卵生動(dòng)物，甲殼類動(dòng)物的卵母細(xì)胞成熟調(diào)控的研究卻極少。 為了進(jìn)一步在蛋白水平研究cyclin B在日本對(duì)蝦卵

3、母細(xì)胞成熟過程中的作用，我們擬構(gòu)建cyclin B原核表達(dá)體系，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步純化。首先.根據(jù)已知的序列設(shè)計(jì)兩條特異引物，摸索條件進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定在1290bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，片斷大小與預(yù)期值相符，且無(wú)非特異性擴(kuò)增帶，可判斷成功擴(kuò)增出目的基因。接著將cyclin B片段連接到溫度誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pBV220上，構(gòu)建pBV220/cyclin B重組子，用菌落PCR和雙酶切方法篩選陽(yáng)性克隆，并DNA測(cè)序

4、進(jìn)行鑒定。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切鑒定及DNA測(cè)序證實(shí)pBV220/cyclin B序列與理論值基本一致，僅第105和110位的氨基酸的密碼子有差異，我們測(cè)的第105位的密碼子是GCA，第110位的密碼子是CTT，而報(bào)道的是GCC和CTG，雖然密碼子不同，可翻譯過來(lái)卻是相同的氨基酸，這樣雖基因序列有所差異，但氨基酸序列卻是完全一樣的。最后把陽(yáng)性重組子分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主菌JM109、DH5a、BL21(DE3)中，溫度誘導(dǎo)表達(dá)，選擇表達(dá)