人巨細(xì)胞病毒PP65基因的克隆及在CHO細(xì)胞中的表達(dá).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:構(gòu)建含CMV啟動(dòng)子、pp65全長和分泌肽的PcDNA5.0轉(zhuǎn)染載體(即HCMV粗制基因疫苗),轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞,建立HCMV pp65蛋白的高效表達(dá)系統(tǒng),為研制HCMV基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ).方法將HCMV AD169株感染W(wǎng)I-38細(xì)胞,收集上清作為實(shí)驗(yàn)用的模板,應(yīng)用PCR法擴(kuò)增pp65全長,轉(zhuǎn)化到pUC118HincⅡ/BAP質(zhì)粒載體,測序;構(gòu)建自制的含CMV啟動(dòng)子、pp65和分泌肽基因的PcDNA5 0轉(zhuǎn)染載體,即擴(kuò)增含

2、CMV啟動(dòng)子及其上下游序列,克隆測序作為新的CMV啟動(dòng)子,人工合成小鼠Igκ鏈分泌肽與pp65基因進(jìn)行酶切、連接,應(yīng)用交換引物的PCR法鑒定.同時(shí)應(yīng)用脂質(zhì)體法將該載體轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞,加入潮霉素進(jìn)行篩選,收集CHO細(xì)胞的上清液進(jìn)行純化,應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳(考馬斯亮藍(lán)染色)、Westen-bloting和Western-ECL system斑點(diǎn)雜交鑒定pp65蛋白.結(jié)論:1.成功地完成了pp65全長的基因克隆.2.構(gòu)建了含有分泌肽、C

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