HGT免疫抗炎活性部位的篩選及其免疫藥理學初步研究.pdf

1、目的：從HGT中分離篩選免疫抗炎活性部位，探討其對實驗性類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的治療作用及其機理，為研制和開發(fā)治療RA的新藥提供實驗依據(jù)。 方法：應用巴豆油誘發(fā)的小鼠急性耳腫脹及二硝基氯苯(DNCB)誘導的小鼠遲發(fā)型超敏反應(DTH)作為免疫抗炎活性的評價指標，觀察對急性炎癥及細胞免疫反應的影響。應用佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型和Ⅱ型膠原誘導的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型，通過觀察足爪腫脹和踝關(guān)節(jié)組織病理變化評價對RA的治療作用；應

2、用ELISA法測定血清中白三烯(LTB<,4>)水平、紫外分光光度法測定足爪浸泡液中前列腺素E2(PGE<,2>)含量的變化，觀察對炎癥介質(zhì)水平的影響；通過<'3>H-TdR摻入法測定脾細胞增殖反應、ELISA法測定脾細胞分泌抗體IgG水平、Luminex技術(shù)測定脾細胞培養(yǎng)上清細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-4水平以及應用流式細胞技術(shù)測定小鼠T細胞亞群和T調(diào)節(jié)細胞數(shù)量，觀察對免疫反應的影響。 結(jié)果： (1)HGT四

3、個提取部位HGT-1、HGT-2、HGT-3和HGT-5均有一定的抗炎和免疫抑制作用，綜合溶解度和可能的毒性等各方面因素，選定了HGT-5進行了進一步分離純化，經(jīng)活性評價確定了其中分子量較大的多糖部位為主要免疫抗炎活性部位，隨后將HGT-5用80％乙醇沉淀得到了目標部位HGT-5A。 (2)HGT-5A在100～500mg/kg灌胃給藥對巴豆油誘發(fā)的小鼠急性耳腫脹具有明顯的抑制作用，在50～100mg/kg灌胃給藥對DNCB誘導

4、的DTH反應具有明顯的抑制作用，并且對DTH模型小鼠脾細胞增殖反應具有明顯的抑制作用；體外實驗發(fā)現(xiàn)，HGT-5A在1～500μg/mL濃度范圍內(nèi)對小鼠脾細胞增殖反應和脾細胞培養(yǎng)上清IgG含量具有濃度依賴性的抑制作用，且無明顯的細胞毒性；僅在1000μg/mL時具有一定的細胞毒性。 (3)HGT-5A在30和60mg/kg灌胃給藥2w可明顯抑制AA大鼠原發(fā)側(cè)和繼發(fā)側(cè)足爪腫脹，改善關(guān)節(jié)組織病理變化，并增強AA大鼠降低的脾細胞增殖反應

5、，減少AA大鼠升高的脾細胞培養(yǎng)上清IgG含量，同時減少關(guān)節(jié)組織中PGE2的含量，而對血清中LTB<,4>作用不明顯，提示HGT-5A對佐劑性關(guān)節(jié)炎具有治療作用，該作用可能與調(diào)節(jié)免疫反應、抑制PGE<,2>炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。 (4)HGT-5A在100和250mg/kg灌胃給藥40d可明顯減輕CIA小鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹，改善踝關(guān)節(jié)的組織病理變化，并降低血清Ⅱ型膠原抗體水平，降低T細胞亞群CD4<'+>/CD8<'+>比值，增加T調(diào)節(jié)

6、細胞(Treg)百分率，降低脾細胞培養(yǎng)上清TNF-α等炎性因子水平，降低Th1細胞分泌的IFN-γ和Th2細胞分泌的IL-4，其中以降低Th1細胞分泌的IFN-γ為主，從而恢復Th1/Th2平衡。提示HGT-5A對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎具有治療作用，該作用可能與其調(diào)節(jié)細胞免疫和體液免疫的平衡，從而抑制Ⅱ型膠原抗體和炎性因子的產(chǎn)生有關(guān)。 (5)化學分析結(jié)果表明，HGT-5A的主要成分為多糖；應用DEAE-纖維素柱層析和凝膠柱層析從HGT