人可溶性4-1BB配體在畢氏酵母中的高效表達及其生物學功能的研究.pdf

1、蘇州大學博士學位論文人可溶性41BB配體在畢氏酵母中的高效表達及其生物學功能的研究姓名：沈麗琴申請學位級別：博士專業(yè)：內(nèi)科血液學指導教師：張學光20030501△里整絲!：!呈!曼竺壟望墨壁墨些窶壟墨苧皇塑堂墊絲塑墮塞生壅塑墨分泌型表達載體pPICZaAs41BBL；SacI限制性內(nèi)切酶酶切使之線性化，再電轉化法將線性化的pPICZaAs4—1BBL質(zhì)粒導入畢氏酵母菌株GSll5，并以同源重組形式整合到酵母染色體的AOX位點，經(jīng)Zeoc

2、in抗性篩選陽性克隆。同時，挑取陽性克隆在含甲醇的培養(yǎng)基中誘導表達，并分別于培養(yǎng)的第24h，48h，72h分別吸出酵母上清，離心后進行IZ％SDSPAGE電泳和WesternBlotting分析鑒是s41BBL的表達情況，得到能在甲醇誘導下穩(wěn)定分泌rhs4一IBBL的基因工程菌GSll5一pPlCZOLA—s4—1BBL。應用全自動發(fā)酵裝置進行發(fā)酵，經(jīng)陰離子交換層析方法分離、純化，獲得純度達95％以上，分子量約21Kda的rhs41BB

3、L重組蛋白，紫外分光光度儀定量其最高表達量達：25ug／ml。二重組人可溶性41BB配體(rhs4一IBBL)的生物學功能探討1rhs41BBL刺激T細胞特性的研究T細胞的活化需要雙重信號，即除Ag一刪C復合物提供的特異性抗原刺激信號外，還需要非抗原特異的和非MHC限制的共刺激信號，T細胞只有獲得這二個信號后，才能發(fā)生有效的活化、增殖，進而發(fā)揮其效應功能，如分泌細胞因子或細胞毒性T細胞(crL)的溶細胞效應。若無第一信號，可導致T細胞失

4、活和死亡。同樣若缺乏共刺激信號，T細胞將進入無反應狀態(tài)，甚至發(fā)生凋亡。活化T淋巴細胞在宿主防御病毒感染、抗腫瘤和移植排斥中發(fā)揮重要作用，并參與自身免疫病的發(fā)展過程。因此，41BB／4一IBBL協(xié)同刺激信號對T細胞的激發(fā)和功能介導起著極其重要的調(diào)節(jié)作用。本研究結果顯示：(1)純化T細胞經(jīng)CD3激發(fā)型單抗刺激后12h，細胞呈現(xiàn)活化狀態(tài)，顯微鏡下觀察細胞增大增多，逐漸成團生長，T細胞表面41BB分子開始表達，約48h達活化高峰，4IBB分子表