人可溶性增殖誘導(dǎo)配體的表達、純化、活性鑒定以及抗體的制備.pdf

1、人可溶性增殖誘導(dǎo)配體(hsAPRIL)是TNF家族的一個較新的成員，它與人B淋巴細胞刺激因子(hBAFF)同屬腫瘤壞死因子超家族的成員，且在該家族中兩者最為接近。本文從人外周血液總RNA中克隆出 hsAPRIL cDNA，利用pET-30a這一原核表達載體成功構(gòu)建并表達了 hsAPRIL蛋白，在對其進行變復(fù)性后得到了其活性蛋白，并進行細胞活性鑒定，證明所得到的確為其活性形式。另一方面以APRIL蛋白為抗原免疫實驗兔，通過心臟取血從血清中

2、得到其抗體，并通過飽和硫酸銨沉淀法以及Protein-A凝膠柱純化該抗體，利用western blotting鑒定抗體，后以ELISA來測定該多抗的效價。實驗設(shè)計及結(jié)果如下： 1 hsAPRIlL cDNA基因的釣取，蛋白的表達、純化及活性鑒定利用RT-PCR技術(shù)從健康人新鮮外周血中釣出增殖誘導(dǎo)配體基因．將其克隆于原核表達載體后，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達目的蛋白，并通過Ni-IDA親和層析柱對該蛋白進行純化，純化后

3、的蛋白通過透析變復(fù)性后得到有活性蛋白，再利用其促進腫瘤細胞增殖這一特性來鑒定其活性。 2 hsAPRIL多克隆抗體的制備及純化將已制備好的抗原每隔10-15天免疫試驗兔，在第三次免疫后從兔耳靜脈取血，測其效價．在確定多抗確有其特異性后從心臟取血得到抗血清．在利用飽和(NH4)SO4沉淀法將抗血清初步純化后再利用 Ptotein-A親和層析柱對其進一步純化．純化產(chǎn)物用western blotting以及ELISA檢測和測定其效價。