玉米S-CMS核育性恢復基因Rf3的精細定位及其候選基因的篩選.pdf

1、植物雜種優(yōu)勢的利用推動了農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)的大幅度提高。玉米是世界上最早將CMS及育性恢復系統(tǒng)應用于雜種優(yōu)勢育種的作物之一。CMS及育性恢復系統(tǒng)為實踐中雜交種的生產(chǎn)提供了巨大的便利，不僅能節(jié)省大量人工去雄，而且可減少因去雄不凈所造成的混雜，充分發(fā)揮雜種優(yōu)勢的作用；同時CMS是研究核質(zhì)互作分子機理的重要模式性狀。玉米S-CMS系的育性由線粒體上育性相關基因和核基因(Rf3/rf3)共同決定。S組CMS是玉米三個主要細胞質(zhì)雄性不育組群中最大的

2、一個組，其育性表現(xiàn)較不穩(wěn)定，影響了其在育種實踐中的應用。為了進一步發(fā)揮玉米S-CMS在雜優(yōu)利用中的作用，克隆育性恢復基因Rf3并闡明育性恢復機理顯得尤其重要。圖位克隆是一種有效的基因克隆方法，其成功的基礎需要有目標基因區(qū)域高分辨率的遺傳圖譜，前人對核育性恢復基因Rf3已進行了定位，但所定位的遺傳圖距較遠，遠不能滿足圖位克隆的需要。 本研究擬在本室前期對玉米S-CMS研究的基礎上，以Rf3/rf3近等基因系S-M017<'Rf3R

3、f3>/s-MO17為材料，利用近等基因系間Rf3區(qū)段的分子標記信息，結(jié)合AFLP分子標記開發(fā)技術(shù)對Rf3進行精細定位，篩選與其緊密連鎖或共分離的分子標記。同時利用cDNA-AFLP技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄水平上研究近等基因系S-MO17<'Rf3Rf3>S-MO17<'rf3rf3>不同發(fā)育時期基因的差異表達譜，以期鑒定玉米S-CMS育性恢復相關基因。主要研究結(jié)果如下： 1．為開展玉米S-型細胞質(zhì)雄性不育核恢復基因的精細定

4、位，選用恢復基因近等基因系(NIL)材料構(gòu)建回交一代群體(S-Mo17<'rf3rf3>×S-Mo17n<'Rf3Rf3>)×N．Mo17<'rf3rf3>。對所有單株進行田間花粉觀察與室內(nèi)鏡檢，二者結(jié)果一致，BC<,1>F<,1>群體中178株被劃分為可育株；165株為不育株，符合1L1分離比，在本研究材料中該育性恢復性狀受一對基因控制。 2．選用Rf3所在的2.09bin區(qū)域的13對SSR標記進行雙親間多態(tài)性篩選，結(jié)果表明，

5、僅標記UMC2184在雙親的2.09 bin區(qū)間存在多態(tài)性，該標記被用于鑒定分析群體中的基因型并作為其它標記的錨定位點。采用EcoRI+MseI、PstI十MseI及．EcoRI+PstI三種酶切方式共528對選擇性擴增引物組合在雙親及DNA池中進行AFLP分析，共產(chǎn)生大約29，000條帶紋。選擇差異性引物組合進一步對可育/不育兩DNA池的單株DNA進行檢測，最終發(fā)現(xiàn)．E3P1、E7P6、E10P7及E12M7共4個標記在個體中的帶型與

6、相應親本一致，其序列相互不重復，代表4個不同的片段，作為候選的緊密連鎖標記進一步在BC<,1>F<,1>群體中檢測基因型。 3．回收標記E3P1、E7P6、E10P7及E12M7對應的差異擴增片段，最終將AFLP標記E3P1及E12M7分別轉(zhuǎn)化為共顯性標記ECAPSE3P1及顯性標記ESCARE12M7。 4．用篩選、驗證所得到的一個sSR標記LJMC2184、2個AFLP標記E7P6、E10P7及2個基于PCR的標記S

7、CAREl2M7、CAPSE3P1構(gòu)建了恢復基因Rf3區(qū)域的遺傳連鎖圖，圖譜全長11.1cM，平均間距為2.22cM。將Rf3定位于AFLP標記E7P6與SCAR標記SCARE12M7之間，遺傳圖距分別為0.9cM和1.8cM。為恢復基因Rf3的圖位克隆奠定了基礎。 5．對分子標記SCARE12M7序列進行BLASTx分析及相關圖譜比較，發(fā)現(xiàn)其與已定位的玉米抗絲黑穗病QTL緊密連鎖或共分離。討論了該標記用于玉米S-CMS育性恢復

8、及絲黑穗抗性雙性狀聚合選擇的潛力的可能性。 6．利用64對引物組合對S-Mo17<'rd3rf3>和S-Mo17<'Rf3Rf3>苗期葉片及抽雄早期花粉進行cDNA-AFLP分析。共顯示TDFs約2500條，片段大小介于80-800bp之間。其中差異表達片段分為質(zhì)的表達差異和量的表達差異兩種類型。質(zhì)的差異表達帶紋共122條，分為7大類型。對在恢復系葉片和花粉中表達但在不育系中沉默和僅在恢復系花粉中表達的33條片段進行序列分析和同

9、源性比較，發(fā)現(xiàn)其分別代表：蛋白質(zhì)降解與貯存相關基因3個，約占9％；轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關基因5個，約占15％；信號轉(zhuǎn)導相關基因4個，約占12％：能量代謝相關基因3個，約占9％；細胞生長與分裂相關基因3個，約占9％；轉(zhuǎn)座子相關基因1個，約占3％；未知蛋白編碼基因9個，約占28％；新發(fā)現(xiàn)的序列5個，約占15％。其中26S proteasome regulatory particle與本室前期利用cDNA芯片的研究結(jié)果表現(xiàn)相同的表達趨勢。用電子拼接及在

10、基因組eDNA中擴增、測序驗證：該基因全長1329bp，編碼443個氨基酸組成的多肽。經(jīng)Clustal W比較分析，玉米26S proteasome regulatory subunit與水稻、擬南芥、人類中同源蛋白質(zhì)序列相似性分別達91％、77％、41％。 7．在已測序的差異表達片段中，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關的基因占15％；對序列E1同源，性搜索發(fā)現(xiàn)：其代表基因編碼蛋白包含PPR模體。對該基因在恢復系及不育系苗期葉片、抽雄期葉片、抽雄