玉米S-CMS核育性恢復(fù)基因Rf3的精細(xì)定位及其候選基因的篩選.pdf

1、植物雜種優(yōu)勢(shì)的利用推動(dòng)了農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)的大幅度提高。玉米是世界上最早將CMS及育性恢復(fù)系統(tǒng)應(yīng)用于雜種優(yōu)勢(shì)育種的作物之一。CMS及育性恢復(fù)系統(tǒng)為實(shí)踐中雜交種的生產(chǎn)提供了巨大的便利，不僅能節(jié)省大量人工去雄，而且可減少因去雄不凈所造成的混雜，充分發(fā)揮雜種優(yōu)勢(shì)的作用；同時(shí)CMS是研究核質(zhì)互作分子機(jī)理的重要模式性狀。玉米S-CMS系的育性由線粒體上育性相關(guān)基因和核基因(Rf3/rf3)共同決定。S組CMS是玉米三個(gè)主要細(xì)胞質(zhì)雄性不育組群中最大的

2、一個(gè)組，其育性表現(xiàn)較不穩(wěn)定，影響了其在育種實(shí)踐中的應(yīng)用。為了進(jìn)一步發(fā)揮玉米S-CMS在雜優(yōu)利用中的作用，克隆育性恢復(fù)基因Rf3并闡明育性恢復(fù)機(jī)理顯得尤其重要。圖位克隆是一種有效的基因克隆方法，其成功的基礎(chǔ)需要有目標(biāo)基因區(qū)域高分辨率的遺傳圖譜，前人對(duì)核育性恢復(fù)基因Rf3已進(jìn)行了定位，但所定位的遺傳圖距較遠(yuǎn)，遠(yuǎn)不能滿足圖位克隆的需要。 本研究擬在本室前期對(duì)玉米S-CMS研究的基礎(chǔ)上，以Rf3/rf3近等基因系S-M017<'Rf3R

3、f3>/s-MO17為材料，利用近等基因系間Rf3區(qū)段的分子標(biāo)記信息，結(jié)合AFLP分子標(biāo)記開發(fā)技術(shù)對(duì)Rf3進(jìn)行精細(xì)定位，篩選與其緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記。同時(shí)利用cDNA-AFLP技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄水平上研究近等基因系S-MO17<'Rf3Rf3>S-MO17<'rf3rf3>不同發(fā)育時(shí)期基因的差異表達(dá)譜，以期鑒定玉米S-CMS育性恢復(fù)相關(guān)基因。主要研究結(jié)果如下： 1．為開展玉米S-型細(xì)胞質(zhì)雄性不育核恢復(fù)基因的精細(xì)定

4、位，選用恢復(fù)基因近等基因系(NIL)材料構(gòu)建回交一代群體(S-Mo17<'rf3rf3>×S-Mo17n<'Rf3Rf3>)×N．Mo17<'rf3rf3>。對(duì)所有單株進(jìn)行田間花粉觀察與室內(nèi)鏡檢，二者結(jié)果一致，BC<,1>F<,1>群體中178株被劃分為可育株；165株為不育株，符合1L1分離比，在本研究材料中該育性恢復(fù)性狀受一對(duì)基因控制。 2．選用Rf3所在的2.09bin區(qū)域的13對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行雙親間多態(tài)性篩選，結(jié)果表明，

5、僅標(biāo)記UMC2184在雙親的2.09 bin區(qū)間存在多態(tài)性，該標(biāo)記被用于鑒定分析群體中的基因型并作為其它標(biāo)記的錨定位點(diǎn)。采用EcoRI+MseI、PstI十MseI及．EcoRI+PstI三種酶切方式共528對(duì)選擇性擴(kuò)增引物組合在雙親及DNA池中進(jìn)行AFLP分析，共產(chǎn)生大約29，000條帶紋。選擇差異性引物組合進(jìn)一步對(duì)可育/不育兩DNA池的單株DNA進(jìn)行檢測(cè)，最終發(fā)現(xiàn)．E3P1、E7P6、E10P7及E12M7共4個(gè)標(biāo)記在個(gè)體中的帶型與

6、相應(yīng)親本一致，其序列相互不重復(fù)，代表4個(gè)不同的片段，作為候選的緊密連鎖標(biāo)記進(jìn)一步在BC<,1>F<,1>群體中檢測(cè)基因型。 3．回收標(biāo)記E3P1、E7P6、E10P7及E12M7對(duì)應(yīng)的差異擴(kuò)增片段，最終將AFLP標(biāo)記E3P1及E12M7分別轉(zhuǎn)化為共顯性標(biāo)記ECAPSE3P1及顯性標(biāo)記ESCARE12M7。 4．用篩選、驗(yàn)證所得到的一個(gè)sSR標(biāo)記LJMC2184、2個(gè)AFLP標(biāo)記E7P6、E10P7及2個(gè)基于PCR的標(biāo)記S

7、CAREl2M7、CAPSE3P1構(gòu)建了恢復(fù)基因Rf3區(qū)域的遺傳連鎖圖，圖譜全長11.1cM，平均間距為2.22cM。將Rf3定位于AFLP標(biāo)記E7P6與SCAR標(biāo)記SCARE12M7之間，遺傳圖距分別為0.9cM和1.8cM。為恢復(fù)基因Rf3的圖位克隆奠定了基礎(chǔ)。 5．對(duì)分子標(biāo)記SCARE12M7序列進(jìn)行BLASTx分析及相關(guān)圖譜比較，發(fā)現(xiàn)其與已定位的玉米抗絲黑穗病QTL緊密連鎖或共分離。討論了該標(biāo)記用于玉米S-CMS育性恢復(fù)

8、及絲黑穗抗性雙性狀聚合選擇的潛力的可能性。 6．利用64對(duì)引物組合對(duì)S-Mo17<'rd3rf3>和S-Mo17<'Rf3Rf3>苗期葉片及抽雄早期花粉進(jìn)行cDNA-AFLP分析。共顯示TDFs約2500條，片段大小介于80-800bp之間。其中差異表達(dá)片段分為質(zhì)的表達(dá)差異和量的表達(dá)差異兩種類型。質(zhì)的差異表達(dá)帶紋共122條，分為7大類型。對(duì)在恢復(fù)系葉片和花粉中表達(dá)但在不育系中沉默和僅在恢復(fù)系花粉中表達(dá)的33條片段進(jìn)行序列分析和同

9、源性比較，發(fā)現(xiàn)其分別代表：蛋白質(zhì)降解與貯存相關(guān)基因3個(gè)，約占9％；轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因5個(gè)，約占15％；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因4個(gè)，約占12％：能量代謝相關(guān)基因3個(gè)，約占9％；細(xì)胞生長與分裂相關(guān)基因3個(gè)，約占9％；轉(zhuǎn)座子相關(guān)基因1個(gè)，約占3％；未知蛋白編碼基因9個(gè)，約占28％；新發(fā)現(xiàn)的序列5個(gè)，約占15％。其中26S proteasome regulatory particle與本室前期利用cDNA芯片的研究結(jié)果表現(xiàn)相同的表達(dá)趨勢(shì)。用電子拼接及在

10、基因組eDNA中擴(kuò)增、測(cè)序驗(yàn)證：該基因全長1329bp，編碼443個(gè)氨基酸組成的多肽。經(jīng)Clustal W比較分析，玉米26S proteasome regulatory subunit與水稻、擬南芥、人類中同源蛋白質(zhì)序列相似性分別達(dá)91％、77％、41％。 7．在已測(cè)序的差異表達(dá)片段中，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因占15％；對(duì)序列E1同源，性搜索發(fā)現(xiàn)：其代表基因編碼蛋白包含PPR模體。對(duì)該基因在恢復(fù)系及不育系苗期葉片、抽雄期葉片、抽雄