甘藍(lán)型油菜隱性核不育恢復(fù)基因BnMS2的精細(xì)定位與候選基因鑒定.pdf

1、油菜是我國(guó)主要的油料作物,而雜種優(yōu)勢(shì)利用又是提高油菜產(chǎn)量、緩解產(chǎn)量與品質(zhì)之間矛盾、增強(qiáng)品種抗(耐)逆性的一條有效途徑。油菜隱性細(xì)胞核雄性不育具有不育性徹底穩(wěn)定、細(xì)胞質(zhì)來(lái)源豐富、恢復(fù)源廣等優(yōu)點(diǎn),在國(guó)內(nèi)已經(jīng)成為雜種優(yōu)勢(shì)利用的一個(gè)重要途徑,但在雜交制種時(shí)需人工拔除母本行中50％的可育株,限制了其廣泛應(yīng)用。隱性細(xì)胞核雄性不育材料S45A的不育性受兩對(duì)重疊隱性基因控制(潘濤等,1988),S45B的BnMs1位點(diǎn)處于雜合狀態(tài),而Brims2位點(diǎn)處

2、于隱性純合狀態(tài)。本研究以S45A和育性正常的普通甘藍(lán)型油菜IL362-2-4為材料通過兩親本的雜交、自交、兄妹交及等位性分析構(gòu)建了在BnMs2位點(diǎn)分離的近等基因系S4516AB,在此基礎(chǔ)上對(duì)隱性核不育基因BnMs2進(jìn)行了精細(xì)定位,克隆和轉(zhuǎn)基因研究,一方面為雄性不育的選育提供分子標(biāo)記,另一方面以期加深對(duì)雄性不育機(jī)理的認(rèn)識(shí)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.對(duì)S4516B和S45B的雜合位點(diǎn)進(jìn)行等位性分析,為S4516AB定位群體的確立

3、打下了基礎(chǔ)。通過對(duì)NIL系S4516AB的育性調(diào)查結(jié)果表明,兄妹交后代的育性分離比為1:1,可育株自交后代的育性比例符合3:1,說(shuō)明S4516B為單位點(diǎn)雜合,結(jié)合等位性分析的結(jié)果證實(shí)了兩型系S4516AB的基因型,不育株S4516A為Bnms1Bnms1Bnms2bnms2,可育株S4516B為Bnms1Brims1BnMs2Bnms2。
　　 2.利用AFLP結(jié)合BSA的分析方法,通過篩選1024對(duì)AFLP引物組合找到了與Bn

4、Ms2連鎖的AFLP標(biāo)記12個(gè),在262株的NIL分離群體中對(duì)BnMs2進(jìn)行了初步定位,將目標(biāo)基因鎖定在3.5cM內(nèi),另外8個(gè)AFLP標(biāo)記與BnMs2共分離。
　　 3.對(duì)12個(gè)AFLP標(biāo)記回收克隆測(cè)序后,用PCR walking分離了8個(gè)共分離標(biāo)記的側(cè)翼序列,延長(zhǎng)后的標(biāo)記序列長(zhǎng)度在815-2661bp之間,并成功轉(zhuǎn)化了5個(gè)SCAR標(biāo)記,其中2個(gè)為共顯性標(biāo)記。繼續(xù)在2650株的不育大群體中采用改良的混合樣品作圖法和側(cè)翼分子標(biāo)記分

5、析法對(duì)BnMs2進(jìn)行精細(xì)定位,將8個(gè)在小群體中共分離的標(biāo)記定位在BnMs2兩側(cè)1.OcM區(qū)域內(nèi),其中最近標(biāo)記Lm10和Lm11距目標(biāo)基因分別只有0.038cM和0.075cM。
　　 4.通過圖譜定位將與BnMs2連鎖的4個(gè)標(biāo)記整合到2個(gè)DH群體(Tapidor×Ningyou7和Quantum×No.2127-17)的連鎖群上,成功將BnMs2定位到甘藍(lán)型油菜C基因組N16染色體上。并在TN群體的N16連鎖群上找到1個(gè)共顯性的

6、SSR標(biāo)記Nal2A05。
　　 5.延伸后的標(biāo)記序列與擬南芥進(jìn)行同源性比較,在擬南芥第1條染色體下方找到一個(gè)包含121個(gè)擬南芥基因的共線性區(qū)域。基于擬南芥基因組信息及網(wǎng)上大量蕓苔屬EST、GSS、BAC序列信息,開發(fā)了1個(gè)ACGM標(biāo)記B14,同時(shí)Lm10經(jīng)1個(gè)白菜BAC為橋梁被定位在擬南芥基因Atlg69510和Atlg69520之間。B14和Lm10將BnMs2在擬南芥上的候選基因縮小到12個(gè)。由于.BnMs2和BnMs1功

7、能相同,都可以恢復(fù)S45A和S4516A不育株的育性,而本定位研究篩選出的12個(gè)候選基因又包括BnMs1的2個(gè)候選基因,因此BnMs2基因也必在BnMs1的2個(gè)候選基因中,將這2個(gè)BnMs2的候選基因命名為BnG1和BnG2。
　　 6.對(duì)2個(gè)候選基因BnG1、BnG2分別構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體p2301G1和p2301G2進(jìn)行互補(bǔ)測(cè)驗(yàn),以S4516AB為外植體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化均獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株。在7株BnG1的轉(zhuǎn)化株中,

8、S4516A沒有能恢復(fù)育性；在3株BnG2的轉(zhuǎn)化株中,也沒有發(fā)現(xiàn)S4516A育性恢復(fù)。
　　 7.根據(jù)BnMs1和BnG2基因cDNA5’端的保守序列構(gòu)建反義表達(dá)載體192301AntiG2,通過轉(zhuǎn)基因?qū)estar中的BnMs1和BnG2進(jìn)行反義抑制,獲得了20株陽(yáng)性株,對(duì)其中12株在花期進(jìn)行育性檢測(cè)沒有發(fā)現(xiàn)預(yù)期的不育表型。
　　 8.構(gòu)建候選基因BnG2啟動(dòng)子的GUS融合基因表達(dá)載體p121P2GUS,對(duì)目標(biāo)基因啟動(dòng)